Tipificación molecular de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en lecherías de Antioquia, Colombia

RESUMEN Objetivo. Determinar la diversidad molecular de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) en muestras ambientales de hatos lecheros colombianos. Materiales y métodos. Las muestras ambientales de 25 hatos lecheros positivos a MAP por IS900-qPCR se cultivaron por duplicado en medio de yema de huevo de Herrold con micobactina J para obtener aislamientos. Las colonias sospechosas fueron confirmadas para MAP por IS900-qPCR. El ADN positivo se subtipó utilizando técnicas de unidades micobacterialess repetitivas intercaladas - número variable de repeticiones en tándem (MIRU-VNTR) y técnicas de repeticiones de multilocus de secuencia corta (MLSSR) para analizar las diferencias genéticas entre los aislamientos. Resultados. El subtipado reveló dos genotipos diferentes por MIRU-VNTR (INMV 2 e INMV 36). La técnica de MLSSR se realizó para aumentar el poder discriminatorio de lo obtenido por MIRU-VNTR, pero no se observaron diferencias entre los aislamientos recuperados. Conclusiones. El presente estudio representa un enfoque importante para el conocimiento del estatus epidemiológico de MAP en la población de estudio.

ABSTRACT Objective. To determine Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) molecular diversity in environmental samples from Colombian dairy herds. Materials and methods. Environmental samples from 25 IS900-qPCR MAP-positive dairy herds were cultured by duplicate in Herrold's egg yolk medium with mycobactin J to obtain isolates. Suspicious colonies were confirmed by MAP-IS900-qPCR. Positive DNA was sub-typed using mycobacterial interspersed repetitive units-variable number of tandem repeat (MIRU-VNTR) and multilocus short sequence repeats (MLSSR) techniques to analyze the genetic differences between the isolates. Results. Sub-typing revealed two different genotypes by MIRU-VNTR (INMV 2 and INMV 36). MLSSR technique was carried out to increase the discriminatory power from what was obtained by MIRU-VNTR, but no differences were observed among the recovered isolates. Conclusions. The present study represents an important approach to the knowledge on MAP epidemiological status in the study population.

Seroprevalencia a Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en bovinos criollos colombianos Romosinuano y costeño con cuernos / Seroprevalence to Mycobacterium aviumsubsp. paratuberculosis in the colombian creole cattle Romosinuano and costeño con cuernos

RESUMEN Objetivo. Determinar la seroprevalencia y los factores epidemiológicos asociados a Mycobacterium avium subsp Paratuberculosis (MAP) en dos razas de bovinos criollos del centro de investigación AGROSAVIA-Turipaná. Materiales y métodos. Se realizó un estudio epidemiológico de corte transversal. Fueron muestreados 848 bovinos criollos, 403 Romosinuanos y 445 costeño con cuernos (CCC); para el diagnóstico serológico de anticuerpos se utilizó la prueba Elisa Indirecta mediante el kit comercial Parachek® de Prionics. Las variables sexo, edad, raza y tipo de hato fueron los factores epidemiológicos evaluados y correlacionados con la presencia de anticuerpos contra MAP; la asociación estadística fue determinada mediante Odds Ratio y con un modelo multivariado de regresión logística, utilizando un nivel de significancia con p<0.05. Resultados. La seroprevalencia general de los bovinos criollos a MAP fue de 2.35% (IC 95%, 1.34-3.38); sin embargo, en los Romosinuano fue de 0.74% y en los CCC fue de 3.82%, siendo las diferencias estadísticamente significativas (valor p=0.003). También, empleando un análisis univariado, fueron más afectados las hembras y los animales mayores a un año. El análisis multivariado identificó como factores epidemiológicos las variables raza y sexo. Conclusiones. En las razas criollas del centro de investigación AGROSAVIA-Turipaná, la seroprevalencia a MAP fue baja; sin embargo, en la raza CCC el riesgo de contraer la enfermedad es seis veces mayor con relación a la raza Romosinuano. Más aún, se pudo evidenciar que las hembras tienen mayor riesgo de adquirir la enfermedad.

ABSTRACT Objective. Determine the seroprevalence and epidemiological factors associated with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in two Creole cattle breeds of the Turipaná research center -AGROSAVIA. Materials and methods. A cross-sectional epidemiological study was conducted,a total of 848 Creole bovine animals were sampled, 403 Romosinuano and 445 costeño con cuernos (CCC); for the serological diagnosis of antibodies, the Elisa Indirect test was used with the commercial kit Parachek®2 by Prionics. The variables sex, age, breed and herd type were the epidemiological factors evaluated and correlated with the presence of antibodies against MAP; the statistical association was established using the Odds Ratio and a multivariate logistic regression model, employing a significance level with p<0.05. Results. The general seroprevalence of the Creole cattle to MAP was 2.35% (95% CI, 1.34-3.38); however, in the Romosinuano it was 0.74% and in the CCC it was 3.82%, being this difference statistically significant (p=0.003). Furthermore, employing a univariate way analysis, females and animals older than one year of age were more affected. The multivariate analysis identified the breed and sex variables as epidemiological factors. Conclusions. In the Creole breeds of the AGROSAVIA-Turipaná research center, MAP seroprevalence was low; however, in the Costeño Con Cuernos breed, the risk of contracting the disease is six times higher than in the Romosinuano breed. Moreover, it was shown that females have a higher risk of acquiring the disease.

Detección de anticuerpos anti-Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) en venados silvestres en Colombia / Detection of anti-Mycobacterium aviumsubsp. paratuberculosis antibodies in wild deer in Colombia

RESUMEN Objetivo. Determinar la presencia de anticuerpos anti-Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) en venados de cola blanca (Odocoileus virginianus) y venados de páramo (Mazama rufína), capturados en las regiones de la Orinoquía y el Caribe en Colombia. Materiales y métodos. Un total de 44 muestras de suero sanguíneo de venados de las especies M. rufína y O. virginianus fueron colectadas en condiciones de campo entre 2014 y 2016. Se utilizó un kit comercial de ELISA para la detección de anticuerpos anti-MAP. Un animal se consideró positivo a ELISA cuando la relación muestra-positivo (S/P%) fue > 0.4, según lo recomendado por el fabricante. Resultados. El 50% (22/44) de los animales muestreados resultaron positivos, lo que corresponde a 10 hembras y 12 machos. Un 81.8% (18/22) y un 77.3% (17/22) de estos animales seropositivos fueron capturados en la región de la Orinoquía y fueron reportados como adultos, respectivamente. Conclusiones. No se sabe cómo o cuándo se introdujo MAP en la población de ciervos colombianos en las regiones de estudio. La hipótesis más plausible para explicar la presencia de anticuerpos anti-MAP en estas poblaciones silvestres es la transmisión por contacto con el ganado bovino infectado, ya que en ambas regiones estas especies comparten pasturas. Este es el primer estudio en explorar la infección por MAP en animales silvestres en Colombia. Estos hallazgos respaldan la necesidad de realizar más estudios utilizando técnicas de diagnóstico directo, y aproximaciones investigativas que permitan la definición de vínculos en la dinámica de la infección entre mamíferos silvestres y domésticos en Colombia.

ABSTRACT Objective. To determine the presence of anti-Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) antibodies in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) and red brocket deer (Mazama rufína), captured in the Orinoquía and Caribbean regions in Colombia. Materials and methods. A total of 44 blood serum samples from deer of species M. rufina and O. virginianus were collected under field conditions between 2014 and 2016. An ELISA commercial kit was used to detect anti-MAP antibodies. An animal was considered ELISA-positive at a sample-to-positive ratio (S/P%) of > 0.4, as recommended by the manufacturer. Results. The 50% (22/44) of the animals were positive, corresponding to 10 females and 12 males. An 81.8% (18/22) and 77.3% (17/22) of these seropositive animals were captured in the Orinoquía region and were reported as adults, respectively. Conclusions. It is not known how or when MAP was introduced in the Colombian deer population in the study regions. The most plausible hypothesis to explain the presence of antibodies against MAP in these wild populations is transmission by contact with infected bovine cattle since, in both regions, these species share pastures. This is the first study to explore MAP infection in wild animals in Colombia. These findings support the need for further studies using different direct diagnostic techniques and research approaches that allow the definition of links in the infection dynamics between wild and domestic mammals in Colombia.

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Colombia (1924-2016): A review / Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en Colombia (1924-2016): Revisión de literatura / Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis na Colômbia (1924-2016): Revisão de literatura

Abstract Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is an acid-fast, gram-positive bacillus. MAP is the causal agent of paratuberculosis (PTB) or Johne's disease, an infectious disease affecting domestic ruminants and some wild species. Its importance as a potentially zoonotic agent due to its relation to Crohn's disease (CD) in humans is still under debate and investigation. The aim of the present systematic review is to summarize original studies on MAP carried out in Colombia since 1924, as well as to establish strengths, weaknesses, and future research opportunities in the country with emphasis on diagnosis and epidemiology. The initial search for existing publications reporting original studies on MAP, PTB, and the relationship between MAP and CD was carried out in the available databases and national libraries. After compilation of the available studies (n = 20), the relevant data was extracted (year, province of report, species studied, diagnostic tests used, study design, summary of results, and authors). Recommendations for future research opportunities on MAP in Colombia are made.

Resumen Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) es un bacilo ácido resistente, gram-positivo. MAP es el agente causal de la paratuberculosis (PTB) o enfermedad de Johne, una enfermedad infecciosa que afecta rumiantes domésticos y algunas especies salvajes. Su importancia como agente zoonótico, debido a su relación con la enfermedad de Crohn (CD) en humanos, está aún en debate y bajo investigación. El objetivo de la presente revisión es exponer los estudios originales sobre MAP llevados a cabo en Colombia desde 1924, así como establecer sus fortalezas, debilidades y oportunidades de investigación futura, con énfasis en los puntos de vista diagnóstico y epidemiológico. La búsqueda inicial de las publicaciones existentes sobre estudios originales realizados acerca de MAP, PTB y la relación MAP y CD fue realizada en las bases de datos disponibles y en bibliotecas nacionales. Luego de la compilación de los estudios disponibles (n = 20), los datos relevantes fueron extraídos (año, provincia de reporte, especie estudiada, prueba diagnóstica usada, diseño del estudio, resumen de resultados y autores). Se hacen recomendaciones para futuras investigaciónes de MAP en Colombia.

Resumo Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) é um ácido forte, bacilo gram-positivo. O MAP é o agente causador da paratuberculosis (PTB) ou doença de Johne, uma doença infecciosa que afecta os ruminantes domésticos e algumas espécies selvagens. Sua importância como um agente zoonótico por causa de sua relação com a doença de Crohn (CD) em humanos ainda está em discussão e sob investigação. O objetivo desta revisão é apresentar a estudos mapa original realizado na Colômbia desde 1924, e estabelecer pontos fortes, pontos fracos e oportunidades para futuras pesquisas no país com ênfase no diagnóstico e epidemiológico pontos de vista. A busca inicial da literatura sobre estudos originais sobre MAP, PTB e a relação MAP e CD foi feita nas bases de dados disponíveis e bibliotecas nacionais. Após a compilação dos estudos disponíveis (n = 20), os dados relevantes foram extraídos (ano, relatório província, espécies estudadas, teste de diagnóstico utilizado, desenho do estudo, os resultados resumo e autores). Foram feitas recomendações sobre futuras oportunidades de pesquisa em MAP em Colômbia.

Fecal culture and two fecal-PCR methods for the diagnosis of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in a seropositive herd / Cultivo fecal y dos métodos de PCR en materia fecal para el diagnóstico de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en un hato seropositivo / Cultivo fecal e dois métodos de PCR em matéria fecal para o diagnóstico de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis em um rebanho soropositivo

Abstract Background: paratuberculosis is a slow-developing infectious disease, characterized by chronic granulomatous enterocolitis. This disease has a variable incubation period from 6 months to over 15 years, and is caused by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Its detection by direct and indirect diagnostic techniques has been of special interest. Objective: to report the diagnosis and detection of MAP using several diagnostic tests in a herd of the Northern region of Antioquia, Colombia. Methods: serum samples from the study herd were analyzed, using a commercial ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit. Fecal samples were cultured by duplicate using Herrold´s egg yolk medium (HEYM), and analyzed by an end- point IS900-specific nested PCR protocol, and a commercial F57-real-time PCR kit. Results: eight out of 27 serum samples in the study herd resulted ELISA-positive. None of fecal samples resulted positive to HEYM culture by duplicate and none were found to be positive by F57-real-time PCR. Seven of the 27 fecal samples were found to be positive by end-point IS900-specific nested PCR. Agreement was found between ELISA and end-point IS900-specific nested PCR in one of the animals. Conclusion: the present study gives information about the agreement between direct and indirect MAP-detection techniques, using different matrixes from animals under the same husbandry conditions.

Resumen Antecedentes: la paratuberculosis es una enfermedad infecciosa de desarrollo lento, caracterizada por una enterocolitis granulomatosa crónica. Esta enfermedad tiene un periodo de incubación que varía entre los 6 meses hasta por más de 15 años, y es causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Su detección por técnicas diagnósticas directas e indirectas ha sido de interés especial. Objetivo: reportar el diagnóstico y detección de MAP utilizando varias técnicas diagnósticas en un hato de la región norte de Antioquia, Colombia. Métodos: se analizaron las muestras de suero del hato de estudio utilizando un kit comercial de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Las muestras de materia fecal fueron cultivadas por duplicado en Herrold´s egg yolk medium (HEYM), y analizadas mediante un protocolo de PCR anidado específico de IS900 y un kit comercial de PCR en tiempo real para F57. Resultados: ocho de las 27 muestras de suero resultaron positivas por ELISA. Ninguna de las muestras de materia fecal resultó positiva al cultivo en HEYM por duplicado ni por PCR en tiempo real para F57. Siete de las 27 muestras de materia fecal resultaron positivas a PCR anidado específico de IS900. Se encontró concordancia entre el resultado de ELISA y de PCR anidado específico de IS900 en uno de los animales. Conclusión: el presente estudio brinda información acerca de la concordancia entre técnicas directas e indirectas de detección de MAP, utilizando diferentes matrices a partir de animales bajo las mismas condiciones de manejo.

Resumo Antecedentes: a paratuberculosis é uma doença infecciosa de evolução lenta, caracterizada por uma enterocolite granulomatosa crônica. Esta doença tem um período de incubação que varia de 6 meses a 15 anos e é causada pelo Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP). Sua detecção por técnicas de diagnóstico diretos e indiretos tem sido de especial interesse. Objetivo: reportar o diagnóstico e a detecção de MAP utilizando várias técnicas de diagnóstico em um rebanho na região norte de Antióquia, Colômbia. Métodos: foram analisadas amostras de soro do rebanho utilizando um kit comercial de ELISA (enzyme- linked immunosorbent assay). As amostras de fezes foram cultivadas em duplicado em Herrold´s egg yolk medium (HEYM) e analisadas utilizando um protocolo de PCR aninhada específico de IS900 e um kit de PCR em tempo real comercial para F57. Resultados: oito das 27 amostras de soro foram positivas para ELISA. Nenhuma das amostras testadas na cultura de fezes HEYM duplicado foram positivas ou na PCR em tempo real para F57. Sete das 27 amostras de fezes foram positivas na PCR aninhada específica para IS900. Foi encontrada concordância entre o resultado de ELISA e PCR aninhada específica para IS900 em um animal. Conclusão: este estudo fornece informações sobre a correlação entre técnicas de detecção direta e indireta do MAP, utilizando diferentes matrizes de animais sob as mesmas condições de condução.

Identifi cation of Mycobacterium avium subspeciesparatuberculosis by PCR techniques and establishment ofcontrol programs for bovine paratuberculosis in dairy herds / Identificación de Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis mediante pruebas dePCR y definición de programa de control de la paratuberculosis bovina en hatos lecheros / Identificação de Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis por PCR edefinição do programa de controle da paratuberculose em rebanhos bovinos leiteiros

The aim of this study was to establish the protocol of conventional and real time PCR for amplificationof Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) genome from bovine fecal samples, as a wayto define strategies for establishing a prevention and control program in a dairy herd at the Universidadde Antioquia (Medellín, Colombia). Fecal samples were individually taken of clinical healthy cows orcows with diarrhea bred in a herd enzootic for Johne’s disease, were processed them for culture in liquidMiddlebrook 7H9 media supplemented with mycobactin under two different protocols: with or withoutinhibitors. Fecal samples from clinically healthy cows were used as negative control. Conventional andreal time PCR were performed with MAP DNA obtained of fecal or cultured samples. The MAP- specificIS900 segment was amplified by using the respective forward and reverse primers. DNA isolated from areference MAP strain was used as positive control of PCR. Data were analyzed by descriptive statisticsand simple regression analysis between PCR and culture results were performed. All samples culturedin media with or without mycobactin gave a positive result compatible with MAP growth. However, only13,3% of samples were positive by real time PCR. There was no relationship neither between PCR and culture results, nor between clinical condition of the cow and MAP positivity. These results support theneed combine culture of feces with PCR diagnosis for identification of MAP-excreting cows in a dairyherd. Finally, a strategy of prevention and control of bovine paratuberculosis is proposed for this enzooticherd and for dairy herds in Colombia.

El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de detección y amplificación del Mycobacteriumavium paratuberculosis (MAP) a partir de muestras de materia fecal bovina, mediante el uso de la técnicade PCR en tiempo real, como estrategia de apoyo para el establecimiento de un programa de prevencióndetección y control de la paratuberculosis bovina en el hato lechero de la Universidad de Antioquia. Muestrasde materia fecal fueron tomadas de bovinos provenientes de un hato enzoótico para la enfermedad de Johne,fueron cultivadas en medio de cultivo líquido Middlebrook 7H9 suplementado con micobactina, bajo dosprotocolos de aislamiento: con o sin inhibidores. Como control negativo fue utilizada muestras de materiafecal de bovinos clínicamente sanos. Adicionalmente, con el DNA de las muestras aisladas en cultivo yde las muestras de materia fecal, fueron hechas pruebas de PCR convencional y en tiempo real, para laamplificación del elemento de inserción IS900 del MAP, mediante el uso de cebadores específicos para esteelemento. Como control positivo se utilizó DNA de MAP de una cepa de referencia. Los resultados fueronevaluados mediante estadística descriptiva y la comparación entre el resultado del cultivo y de la pruebade PCR fue evaluado mediante regresión simple. Los resultados del cultivo bacteriológico, mostraron untotal de 15 muestras con crecimiento compatible con MAP, el cual fue verificado por prueba de PCR enel 13.3% de los casos. No hubo correlación entre el resultado de cultivo y la prueba de PCR ni entre elestado clínico y la positividad al MAP. Los resultados confirman la necesidad de combinar el diagnósticomolecular con el cultivo bacteriológico para identificar las vacas positivas en un hato. Finalmente, unaestrategia de prevención y control de la enfermedad aplicable a este hato enzoótico y a los hatos lecherosen Colombia es discutida.

O objetivo deste estudo foi estabelecer um sistema de detecção e amplificação do Mycobacterium aviumparatuberculosis (MAP) a partir de amostras fecais bovinas, utilizando a técnica de PCR em tempo real,como uma estratégia para apoiar o estabelecimento de um programa rastreio para a prevenção e controlede la paratuberculosis bovina no rebanho leiteiro da Universidade de Antioquia. Foram colhidas amostrasde fezes de gado bovino a partir de uma fazenda enzoótica para a doença de Johne, e foram cultivadasem meio de cultura líquida Middlebrook 7H9 suplementado com micobactina, sob dois protocolos deisolamento: com ou sem inibidores. Foram utilizadas como controle negativo amostras fecais de bovinossaudáveis. Além disso, as amostras de DNA isoladas e cultivadas a partir de amostras fecais foramrealizadas testes de PCR convencional e em tempo real, para amplificação elemento de inserção IS900 noMAP. Foi utilizado como controle positivo do teste DNA de uma estirpe de referencia. Os resultados foramavaliados por estatística descritiva e as comparações entre os resultados de cultura e teste PCR foramavaliadas por regressão simple. Os resultados de cultura bacteriológica mostraram 100% de crescimentoem amostras com MAP, que foi verificada por PCR em 13,3% dos casos. Não houve correlação entre oresultado do cultivo e teste PCR ou entre a clínica e a positividade para MAP. Os resultados confirmam anecessidade de combinar o diagnóstico molecular com cultura bacteriológica para identificação positivade vacas em um rebanho. Finalmente, uma estratégia de prevenção e controle da doença aplicável nesterebanho enzoótico e os rebanhos leiteiros e na Colômbia é discutida.

Infección por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en un rebaño criollo limonero / Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in a criollo limonero herd

El objetivo de este estudio consistió en definir, analizar y evaluar la situación de un rebaño Criollo Limonero elite en relación a la paratuberculosis bovina. La investigación se llevó a cabo utilizando las variables epidemiológicas y el análisis de muestras (leche y suero) mediante inmunoensayo enzimático (ELISA) comercial. Posteriormente, se tomaron como base estos resultados y utilizando otras herramientas diagnósticas como la exploración clínica, tinción directa, cultivos, identificación mediante ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y estudio histomorfológico, todas ellas dirigidas a confirmar el estado de la infección. Los resultados permiten aseverar la existencia de infección por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAsP) en tasas de positividad variable. La técnica de ELISA mostró alta capacidad en la identificación de animales subclinicamente afectados, lo que demuestra su potencial como prueba primaria de diagnóstico en el establecimiento de futuros programas de control. La técnica de amplificación por PCR reveló la presencia de genoma de subespecies de Mycobacterium avium, lo cual apoya fuertemente la presunción de infección en estos animales por MAsP, pese a la imposibilidad de lograr claras evidencias clínicas, clinicopatológicas, microbiológicas e histopatológicas que permitieran corroborar este dictamen. La estrecha correlación entre los resultados de ELISA y PCR, ratifica no sólo la confirmación diagnóstica, sino también validan los datos obtenidos a través de la prueba serológica.

The purpose of this research was to define, analyze and evaluate the situation of an elite Criollo Limonero herd related to bovine paratuberculosis. The investigation was carried out using the epidemiological variables and samples analysis (milk and serum) through a commercial enzyme immunoassay (ELISA). The results of the above test were taken as a foundation to use other diagnostic tools, such as clinical examination, direct staining, bacterial culture, identification through polymerase chain reaction (PCR) and histopathologic studies, to find out the status of the disease. The results allowed asserting the infection by the presence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAsP) in positive variable rates. The ELISA technique showed high capacity in identification of the sub clinical affected animal, which proved its potential as a diagnostic primary test in the establishment of future control programs. The PCR amplification revealed Mycobacterium avium subspecie genome presence, which lead to predict these animals infection by MAsP, in spice of the impossibility to accomplish clear clinical, clinic pathologic, microbiologic and histopathologic evidences that allowed corroborating the diagnosis. The narrow relation between ELISA and PCR results ratified not only the diagnostic confirmation, but also they validated the data collected through the serological test.