Produção e purificação integrada de protease fibrinolítica de Mucor subtilissimus UCP 1262 / Integrated production and purification of fibrinolytic protease from Mucor subtilissimus UCP 1262

As enzimas fibrinolíticas podem ser obtidas de micro-organismos por meio de processos fermentativos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção e extração integrada da protease fibrinolítica de Mucor subtilissimus UCP 1262 usando sistema de duas fases aquosas (SDFA). O processo integrado foi realizado para avaliar a produção, partição e recuperação da protease fibrinolítica, segundo planejamento experimental 23, utilizando como variáveis independentes a massa molar do polietileno glicol (PEG), a concentração do PEG e a concentração do sulfato de sódio. A maior atividade fibrinolítica (15,40U/mL) foi obtida na fase rica em sulfato de sódio no ensaio composto por 10% de sal e 18% de PEG 8000 (g/mol). Recuperações superiores a 80% foram obtidas. A protease fibrinolítica apresentou pH ótimo 7,0, estabilidade entre os pH 6,0 e 8,5, temperatura ótima 50°C, sendo estável de 10°C a 50°C. A enzima foi classificada como uma serino protease, com massa molecular de 52kDa. Como resultado, o processo é notavelmente eficaz para pré-purificar a protease fibrinolítica com baixo custo e rapidez significativa. Quando comparada a outras técnicas de produção e purificação isoladas, a fermentação extrativa é um processo digno a ser substituto das etapas iniciais de separação convencionais.(AU)

Fibrinolytic enzymes can be obtained from microorganisms through fermentative processes. The study aimed to evaluate the fibrinolytic protease production and integrated extraction from Mucor subtilissimus UCP 1262 by extractive fermentation using Aqueous Two-Phase Systems (ATPS). The integrated process was carried out to assess the production, partition and fibrinolytic enzyme recovery, according to a 2 3 -experimental design, using as independent variables Polyethylene glycol (PEG) molar mass, PEG and sodium sulphate concentration, concentration. The highest fibrinolytic activity (15.40U/mL) was obtained in sodium sulfate rich phase in the assay comprising of 10% of salt and 18% of PEG 8000 (g/mol). Yield greater than 80% was obtained. The fibrinolytic protease presented optimum pH 7.0 and stability between pH 6.0 and 8.5, and optimum temperature 50°C, stable between 10°C to 50°C. The enzyme was classified as a serine-protease with 52kDa of molecular weight. As a result, the process is remarkably effective to pre-purify the fibrinolytic protease with a low cost and significantly faster processing time. When compared to other isolated production and purification techniques the extractive fermentation is worthy of being a candidate to replace the initial stages of conventional separation processes.(AU)

Utilização de sistemas poliméricos de duas fases aquosas (SPDFA) compostos por polietileno glicol/ácido poliacrílico (PEG/APA) para extração de ácido clavulânico / Utilization of aqueous two phase systems (ATPS) composed of polyethylene glycol/polyacrylic acid (PEG/APA) in the extraction of clavulanic acid

A viabilidade da produção em escala industrial de produtos biotecnológicos de interesse comercial e terapêutico, como os fármacos, depende significativamente das técnicas de separação e purificação utilizadas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de biomoléculas, de modo que estas não percam sua atividade ou propriedades desejadas. Esta técnica é interessante para a purificação em larga escala, pois permite partição seletiva, com potencial de obtenção de altos rendimentos, além de apresentar boa relação custo-benefício. O presente trabalho estudou a purificação por extração líquido-líquido do ácido clavulânico em SDFA utilizando um novo sistema polimérico aquoso, formado pelos polímeros polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (APA). Foram estudadas diferentes composições do sistema polimérico aquoso PEG/APA, empregando diferentes massas molares e concentrações para o PEG e utilizando a massa molar 8000g/mol para o APA. Com base nas informações obtidas o melhor ponto de extração para o ácido clavulânico na presença de Na2SO4 foi definido como MPEG=400 g/mol, CPEG=17,5% (m/m) e CNaPA=22,5% (m/m) com K= 19,14, ηT=91,21%, BM=101,69 e R=0,45. Enquanto que na presença de NaCl, o melhor ponto encontrado foi: MPEG=400 g/mol, CPEG=35% (m/m) e CNaPA=10% (m/m) com K=11,96 ηT=80,04%, BM=90,18 e R=0,66. No trabalho será avaliada, também, a influência da temperatura, pH e força iônica nesse sistema. Estabeleceram-se os melhores parâmetros de separação do ácido clavulânico presente em meio fermentado produzido por Streptomyces clavuligerus utilizando a metodologia de fermentação extrativa com SDFA PEG/APA. O efeito do ácido clavulânico no diagrama de fases do sistema PEG-APA, bem como sua partição na forma pura e na presença de homogeneizado celular, foi estudado principalmente através da determinação do coeficiente de partição e recuperação do respectivo fármaco

The viability of industrial scale production of commercial and therapeutical biotechnological products, such as drugs, is significantly dependent on the separation and purification techniques applied. The use of two-aqueous phase systems (ATPS) is proposed as an alternative to purification because it allows the separation and analysis of biomolecules, so that they do not lose their activities or desired properties. This technique is interesting for large scale purification because it allows selective partition with high potential yield and good cost/benefit ratio. The present work studied the purification of clavulanic acid (CA) by liquid-liquid extraction in ATPS applying a new aqueous polymeric system composed of two polymers, namely polyethylene-glicol (PEG) and sodium polyacrylate (NaPA). Different compositions of the aqueous polymeric system (PEG/PAA) were utilized, employing different PEG molar masses (MPEG) and concentrations (CPEG) and a molar mass of PAA of 8000 g/mol. In the light of the results obtained, the best conditions for clavulanic acid extraction, in the presence of Na2SO4, were MPEG = 400 g/mol, CPEG = 17.5% (m/m) and CNaPA = 22.5% (m/m), which allowed obtaining a partition coefficient (K) of 19.14, a yield in the top phase (ηT) of 91.21%, a mass balance (MB) of 101.69 and a volume ratio (R) of 0.45. On the other hand, in the presence of NaCl, the best results (K = 11.96, ηT = 80.04%, MB = 90.18 and R = 0.66) were found at: MPEG = 400 g/mol, CPEG = 35% m/m and CNaPA = 10% m/m. The effect of clavulanic acid in the PEG-PAA system phase diagram and its partition either in its pure form or in the cell homogenate were studied mainly through both the determination of the partition coefficient and the recovery of the drug selected for this study

Produção e extração de ácido clavulânico de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistemas de duas fases aquo / Production and extraction of clavulanic acid from Streptomyces spp. by extractive fermentation using aqueous two-phase system

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32ºC, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32ºC e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32ºC é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC...

Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 ºC, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 ºC and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 ºC is the maximum temperature production of CA, after this value, starts…