Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos

Abstract This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Resumo Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P 0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P 0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P 0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P 0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Use of melatonin as an inhibitor of apoptotic process for cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) embryos / Uso da melatonina como inibidor do processo apoptotico para a criopreservação de embriões de zebrafish (Danio rerio)

This study investigated the use of melatonin to arrest the effects of apoptosis in vitrified zebrafish (D. rerio) embryos. Dechorionated embryos at 22-24 somite-stage were divided (n = 60/treatment) into a non-vitrified (Control Group, 0 M melatonin) and vitrified treatments with 0 M (T1), 1 µM (T2) and 1 mM of melatonin (T3). For vitrified treatments, a solution methanol/propylene glycol based was used and the embryos stored in -196 °C for a week. After thaw, survival rate, scanning electron microscopy, expression of anti (bcl-2) and pro-apoptotic (bax/caspase-3) genes, reactive oxygen species (ROS) formation and DNA fragmentation analyses were performed. No live embryos were obtained from vitrified treatments, observing a rapid degeneration immediately after thawing, with the vitelline layer rupture and leakage of its content, followed by breakdown of epithelial cells and melanisation of the tissue. Regarding the apoptotic process, T3 had the highest relative gene expression, for the three genes (P < 0.05) furthermore, T2 had similar expression of pro-apoptotic genes to CG (P < 0.05). ROS formation revealed that CG presented lower percentage of embryo surface area affected (3.80 ± 0.40%) (P < 0.05), in contrast, no differences were found among the other groups. T1 was most significantly (P < 0.05) damaged by DNA fragmentation. The vitrified groups with melatonin had similar damage levels of CG (P > 0.05). The inclusion of 1 µM of melatonin in the vitrifying solution, countered the effects of apoptotic process in post-thaw embryos, suggesting its utility in cryopreserving fish embryos.

Este estudo investigou o uso da melatonina para conter os efeitos da apoptose em embriões vitrificados de zebrafish (D. rerio). Embriões descorionados no estágio de 22-24 somitos foram divididos (n = 60 / tratamento) em tratamento não vitrificado (Grupo Controle, melatonina 0 M) e tratamentos vitrificados com 0 M (T1), 1 µM (T2) e 1 mM de melatonina (T3). Para os tratamentos vitrificados, utilizou-se uma solução à base de metanol/propilenoglicol e os embriões foram armazenados em -196 °C por uma semana. Após o descongelamento, foram realizadas análises de taxa de sobrevivência, microscopia eletrônica de varredura, expressão dos genes anti (bcl-2) e pró-apoptóticos (bax/caspase-3), formação de espécies reativas de oxigênio (EROS) e análises de fragmentação de DNA. Não foram obtidos embriões vivos a partir dos tratamentos vitrificados, observando uma rápida degeneração imediatamente após o descongelamento, com ruptura da camada vitelina e vazamento de seu conteúdo, seguida de quebra das células epiteliais e melanização do tecido. Em relação ao processo apoptótico. T3 apresentou expressão gênica relativa alta para os três genes (P <0,05), além disso, T2 apresentou expressão semelhante as dos genes pró-apoptóticos de GC (P <0,05). A formação de EROS revelou que GC apresentou menor percentual de área de superfície embrionária afetada (3,80 ± 0,40%) (P <0,05), ao contrário, não foram encontradas diferenças entre os outros grupos. T1 foi mais significativamente (P <0,05) danificado pela fragmentação do DNA. Os grupos vitrificados com melatonina apresentaram níveis de dano semelhantes ao do GC (P> 0,05). A inclusão de 1 µM de melatonina na solução de vitrificação, contrariou os efeitos do processo apoptótico em embriões pós-descongelamento, sugerindo sua utilidade na criopreservação de embriões de peixes.

Assessment of heavy metals and its impact on DNA fragmentation in different fish species / Avaliação de metais pesados e seu impacto na fragmentação de DNA em diferentes espécies de peixe

Abstract This study was conducted to assess water pollution by examining DNA fragmentation in selected fish organs (kidney, liver, gills, and muscle tissue) from Wallago attu, Sperata sarwari, Vulgaris vulgaris, and Labeo rohita collected from a known polluted section of the Chenab River, Pakistan, and from a control site. The fish were caught using a gill net and were assigned to three different weight groups (W1, W2, and W3) to study the degree of variation in DNA fragmentation in relation to body weight. In fish from the polluted site, DNA fragmentation was higher in kidney, liver, gills, and muscles, compared to the control. No significant DNA fragmentation was observed in fish collected from the control site. Highly significant (P < 0.01) relationship between body weight and DNA fragmentation was found in the organs of fish procured at the contaminated site. DNA fragmentation in body organs was found to be affected by the concentrations of lead, copper, nickel, and cadmium in W. attu, S. sarwari, L. rohita, and V. vulgarus harvested from Chenab River. DNA fragmentation in different freshwater fish species is therefore a reliable biomarker of water pollution.

Resumo Este estudo foi conduzido para avaliar a poluição da água examinando a fragmentação do DNA em órgãos de peixes selecionados (rim, fígado, brânquias e tecido muscular) de Wallago attu, Sperata sarwari, Vulgaris vulgaris e Labeo rohita coletados de uma conhecida área poluída do rio Chenab, Paquistão e de um local de controle. Os peixes foram capturados usando uma rede branquial e foram divididos em três grupos de pesos diferentes (W1, W2 e W3) para estudar o grau de variação na fragmentação do DNA em relação ao peso corporal. Nos peixes do local poluído, a fragmentação do DNA foi maior nos rins, fígado, brânquias e músculos, em comparação ao controle. Não foi observada fragmentação significativa do DNA em peixes coletados no local de controle. Relação altamente significativa (P <0,01) entre o peso corporal e a fragmentação do DNA foi encontrada nos órgãos dos peixes adquiridos no local contaminado. Verificou-se que a fragmentação do DNA nos órgãos do corpo é afetada pelas concentrações de chumbo, cobre, níquel e cádmio em W. attu, S. sarwari, L. rohita e V. vulgarus colhidos no rio Chenab. A fragmentação do DNA em diferentes espécies de peixes de água doce é, portanto, um biomarcador confiável da poluição da água.

Assessment of heavy metals and its impact on DNA fragmentation in different fish species

Abstract This study was conducted to assess water pollution by examining DNA fragmentation in selected fish organs (kidney, liver, gills, and muscle tissue) from Wallago attu, Sperata sarwari, Vulgaris vulgaris, and Labeo rohita collected from a known polluted section of the Chenab River, Pakistan, and from a control site. The fish were caught using a gill net and were assigned to three different weight groups (W1, W2, and W3) to study the degree of variation in DNA fragmentation in relation to body weight. In fish from the polluted site, DNA fragmentation was higher in kidney, liver, gills, and muscles, compared to the control. No significant DNA fragmentation was observed in fish collected from the control site. Highly significant (P 0.01) relationship between body weight and DNA fragmentation was found in the organs of fish procured at the contaminated site. DNA fragmentation in body organs was found to be affected by the concentrations of lead, copper, nickel, and cadmium in W. attu, S. sarwari, L. rohita, and V. vulgarus harvested from Chenab River. DNA fragmentation in different freshwater fish species is therefore a reliable biomarker of water pollution.

Resumo Este estudo foi conduzido para avaliar a poluição da água examinando a fragmentação do DNA em órgãos de peixes selecionados (rim, fígado, brânquias e tecido muscular) de Wallago attu, Sperata sarwari, Vulgaris vulgaris e Labeo rohita coletados de uma conhecida área poluída do rio Chenab, Paquistão e de um local de controle. Os peixes foram capturados usando uma rede branquial e foram divididos em três grupos de pesos diferentes (W1, W2 e W3) para estudar o grau de variação na fragmentação do DNA em relação ao peso corporal. Nos peixes do local poluído, a fragmentação do DNA foi maior nos rins, fígado, brânquias e músculos, em comparação ao controle. Não foi observada fragmentação significativa do DNA em peixes coletados no local de controle. Relação altamente significativa (P 0,01) entre o peso corporal e a fragmentação do DNA foi encontrada nos órgãos dos peixes adquiridos no local contaminado. Verificou-se que a fragmentação do DNA nos órgãos do corpo é afetada pelas concentrações de chumbo, cobre, níquel e cádmio em W. attu, S. sarwari, L. rohita e V. vulgarus colhidos no rio Chenab. A fragmentação do DNA em diferentes espécies de peixes de água doce é, portanto, um biomarcador confiável da poluição da água.

Evaluation of pro-apoptotic activity of Chelidonium majus L. and/or gamma-radiation against ehrlich as carcinoma transplanted in mice / Avaliação da atividade pró-apoptótica da Chelidonium majus L. e/ou radiação gama contra o tumor ascítico de ehrlich transplantado em ratos

This study was to evaluate, the pro-apoptotic activity of ethanolic Chelidonium majus L. (CM) leaf extract and/or gamma-radiation in Ehrlich ascites carcinoma (EAC) bearing mice by measuring tumor volume, apoptotic factors (caspase-3, Bcl-2 and Bax proteins, tumor necrosis factor-alpha (TNF-), angiogenesis factors (matrix metalloproteinase (MMP-2 and MMP-9); tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP-1), DNA fragmentation, besides histopathological examination. After tumor inoculation, mice received CM (100 mg/body weight/day) on the 10th day and were exposed to whole body -radiation (6Gy) on the 17th day. The data obtained reveales that combining CM with - radiation exposure induce significant regression in tumor growth, up-regulate Bax, caspase-3, TIMP-1 and inhibit Bcl-2, TNF-, MMP-(2 and 9). Cytotoxicity is substantiated by increased DNA-fragmentation (comet assay and DNA content) and histological examination. It could be suggested that combining CM with gamma-radiation increased apoptosis of tumor cells which would help to increase the lifespan of mice.

Este estudo foi realizado para avaliar a atividade pró-apoptótica do extrato etanólico da folha da Chelidonium majus L. (CM) e/ou radiação gama no tumor ascítico de Ehrlich tendo ratos para a medição do volume do tumor, fatores apoptóticos (caspase-3, proteínas Bcl-2 e Bax, fator de necrose tumoral (TNF-)), fatores angiogênicos (metaloproteinase matriz (MMP-2 e MMP-9)); inibidor tecidual de metaloproteinase (TIMP-1), fragmentação de DNA, além de exame histopatológico. Depois da inoculação do tumor, os ratos receberam CM 100 mg/peso corporal/dia no 10º dia e tiverem o corpo completo exposto a radiação gama (6Gy) no 17º dia. Os dados obtidos revelam que combinar CM com exposição à radiação gama induz a uma regressão significativa no crescimento do tumor, regula positivamente Bax, caspase-3, TIMP-1 e inibe Bcl-2, TNF-, MMP-(2 e 9). Citotoxicidade é substanciada pelo aumento da fragmentação do DNA (ensaio cometa e conteúdo de DNA) e exame histopatológico. Poderia ser sugerido que combinar CM com radiação gama aumentou a apoptose das células tumorais o que ajudaria a aumentar a expectativa de vida dos ratos.

Efecto de la centrifugación sobre la membrana plasmática y el ADN de espermatozoides bovinos / Efeito da centrifugação sobre a membrana plasmática e o DNA de espermatozóides bovinos / Effect of centrifugation on plasma membrane and DNA of bovine spermatozoa

El objetivo de este estudio fue determinar si la integridad de la membrana plasmática y el ADN de los espermatozoides pueden ser afectados por la centrifugación realizada en el proceso de lavado y selección. Los espermatozoides fueron sometidos a diferentes tiempos de centrifugación (10, 30 y 45 min); se utilizó un control negativo con espermatozoides no centrifugados y un control positivo con espermatozoides sometidos a estrés oxidativo con peroxido de hidrógeno (H2O2) (200 μM). Para evaluar la integridad de la membrana se utilizó la prueba hipoosmótica (HOST) y para evaluar la fragmentación del ADN se utilizó el ensayo cometa: El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Fisher. La centrifugación durante 10, 30 y 45 min, presentó un efecto estadísticamente significativo sobre el daño en el ADN, respecto de los espermatozoides no centrifugados (p<0.05). Además, se observó diferencia estadística significa (p<0.05) entre los espermatozoides centrifugados a diferentes tiempos con respecto al control positivo realizado con H2O2 (200 μM). La comparación de medias no indicó diferencia estadística significativa entre los espermatozoides no centrifugados y los centrifugados por un periodo de 10 y 30 min (p>0.05) en la reacción positiva a la prueba HOST, lo cual sí sucedió (p<0.05) al comparar los no centrifugados y los centrifugados por 45 min. El control positivo realizado con H2O2 presentó diferencia significativa (p<0.05) con el resto de los tratamientos. En conclusión, los resultados del presente trabajo sugieren que la centrifugación de los espermatozoides durante 10, 30 ó 45 min a 700 x g para la realización del gradiente diferencial de Percoll, tiene un efecto deletéreo sobre el ADN de los espermatozoides bovinos y que la centrifugación por 45 min además de causar daño en el ADN produce pérdida de la integridad de la membrana plasmática.

O objetivo de este estudo foi determinar se a integridade da membrana plasmática e o DNA dos espermatozóides podem ser afetados pela centrifugação realizada no processo de lavado e seleção. Os espermatozóides foram submetidos a diferentes tempos de centrifugação (10, 30 e 45 min); foi utilizado um controle negativo com espermatozóides não centrifugados e um controle positivo com espermatozóides submetidos a estresse oxidativo com peróxido de hidrogênio (H2O2) (200 μM). Para avaliar a integridade da membrana foi utilizado o teste hipoosmótica (HOST) e para avaliar a fragmentação do DNA Fo utilizado o ensaio cometa: A análise estatística se realizou mediante o teste de Fisher. A centrifugação durante 10, 30 e 45 min, apresentou um efeito estatisticamente significativo sobre o dano no DNA, em relação aos espermatozóides não centrifugados (p<0.05). Além disto, observou-se diferença estatisticamente significativa (p<0.05) entre os espermatozóides centrifugados a diferentes tempos em relação ao controle positivo realizado com H2O2 (200 μM). A comparação de medias não detectou diferença estatisticamente significativa entre os espermatozóides não centrifugados e os centrifugados por um período de 10 e 30 min (p>0.05) na reação positiva à prova HOST, o qual ocorreu ao comparar os não centrifugados e os centrifugados por 45 min (p<0,05). O controle positivo realizado com H2O2 apresentou diferença significativa (p<0.05) quando comparado contra os outros tratamentos. Em conclusão, os resultados do presente trabalho sugerem que a centrifugação dos espermatozóides durante 10, 30 ou 45 min a 700 x g para realização do gradiente diferencial de percoll, têm um efeito deletério sobre o DNA dos espermatozóides bovinos e que a centrifugação por 45 min além de causar dano no DNA produz perda da integridade da membrana plasmática.

The aim of this study was to evaluate the effects of different times of centrifugation on plasma membrane integrity and DNA of bovine sperm cells, by means of the hyposmotic test (HOST) and the comet assay, respectively. The sperm cells were centrifuged at 700 x g for 10, 30 or 45 min. No-centrifuged thawed semen served as negative control whereas hydrogen peroxide (H2O2) (200 mM) treated sperm cells were used as a positive control. The results indicate that while the integrity of the plasma membrane was not affected by centrifugation, bovine sperm DNA was damaged independently of centrifugation times. Significant differences between negative control and treatments were found (p<0.05) and in the same way, between treatments and positive control, where the damage for oxidative stress was greater. These results indicate that centrifugation could be detrimental for in vitro bovine embryo production. Additionally, some grade of DNA fragmentation in not centrifuged sperm cells (negative control) was registered, suggesting that DNA of bovine sperm cells could be affected by other factors, probably freezing procedure.