Multienzyme and Antibacterial Potential of Bacteria Isolated from gut of Asian Honey Bee (Apis cerana Indica), Lahore Using Culture Dependent Method

Abstract The bacteria residing in the gut of honey bees (HB) has demonstrated a significant role in protecting bees against various pathogens, production of honey and wax. However, no information exists about the antibacterial potential of bacterial isolates from gut of Asian HB, Apis cerana Indica F. (Hymenoptera: Apidae), against human pathogens. This study aims to investigate the antibacterial and multienzyme potential of aerobic bacteria from A. cerana gut using culture dependent approach. A total of 12 HB gut bacteria were characterized morphologically and biochemically. These strains were further screened for their antimicrobial activity against pathogenic human microorganisms Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis using cross streak (primary screening) and agar well diffusion methods (secondary screening). Preliminary characterization of cell-free supernatant (CFS) of two promising isolates was performed by measuring lactic acid concentrations, enzymatic digestion of antimicrobial compounds, stability over a range of temperature, pH and amplification of spaS (subtilin) and spoA (subtilosin) genes. In primary screening, among 12 HB isolates, eight strains showed statistically significant highest zones of inhibition (p≤0.05) against E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa. 16S rRNA sequencing revealed that these isolates belong to Bacillus genus, identified as B. tequilensis, B. pumilus, B. xiamenensis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. safensis, B. licheniformis, B. altitudinis (Accession numbers: MT186230-MT186237). Secondary screening revealed that among eight isolates, B. subtilis and B. amyloliquefaciens showed statistically significantly strong inhibition (p≤0.05) against all tested pathogens. Antibiotic susceptibility testing revealed that both isolates were resistant to antibiotics and possesses proteolytic, lipolytic and cellulolytic activities. The nature of the compound causing inhibitory activity was found to be proteinaceous and showed stability over a wide range of temperature as well as pH. PCR study confirmed the presence of bacteriocins by successful amplification of important antimicrobial peptide biosynthesis genes spaS and spoA. These results suggest that the HB gut is a home to bacteria that possess antimicrobial activity and important enzymes with antimicrobial potential. To our knowledge, this is the first report demonstrating the antimicrobial potential of bacteria isolated from gut of HB (A. cerana) against human pathogens.

Black queen cell virus and Nosema ceranae coinfection in Africanized honey bees from southern Brazil / Coinfecção por vírus da realeira negra (BQCV) e Nosema ceranae em abelhas africanizadas no sul do Brasil

Bees are fundamental in several aspects, especially in relation to plant biodiversity and pollination. Recently, immense losses are being faced in the number of Brazilian colonies, mainly in southern states of the country, which has a strong beekeeping activity. There are indications that, among the reasons for the losses, pathogens that affect the health of bees may be involved. Among them, the microsporidium Nosema and the black queen cell virus (BQCV) stand out for their prevalence. In this study, 92 colonies of 17 apiaries from southern Brazil were evaluated for infection by Nosema ceranae, Nosema apis and BQCV. Nucleic acid extractions and cDNA synthesis were performed from adult bee samples, followed by Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and multiplex PCR. Eight BQCV positive samples were subjected to sequencing. The results showed that N. ceranae and BQCV are circulating in the Southern region of the country, which may be the reason for the loss of colonies. N. apis was not found. N. ceranae was found in 57.6% (53/92) of the colonies and BQCV in 32.6% (30/92). Co-infection was found in 25% (23/92) of the colonies studied, a factor that is suggested to be reducing the hosts' longevity due to the synergistic action of the pathogens. The samples submitted to sequencing indicated similarity of 96.8 to 100% between them, in addition to strong similarity with sequences from Asia, United States, Germany and Peru. This study reports the circulation of N. ceranae and BQCV in apiaries in southern Brazil, in addition to being the first phylogenetic analysis of the Brazilian BQCV sequence.(AU)

As abelhas mostram-se fundamentais em diversos aspectos, especialmente com relação à biodiversidade de plantas e polinização. Recentemente, estão sendo enfrentadas imensas perdas no número de colônias brasileiras, principalmente nos estados do sul do país, com forte atividade apícola. Há indicativos de que, dentre as razões para as perdas, possam estar envolvidos patógenos que afetam a saúde das abelhas. Dentre eles, o microsporídio Nosema e o vírus da realeira negra (BQCV) destacam-se pela prevalência. Neste estudo, foram avaliadas 92 colônias, de 17 apiários do sul do Brasil, a respeito da infecção por Nosema ceranae, Nosema apis e BQCV. Foram realizadas extrações de ácidos nucleicos e síntese de cDNA a partir de amostras de abelhas adultas, seguidos de Reação em Cadeia da Polimerase-Transcriptase Reversa (RT-PCR). Oito amostras positivas para BQCV foram submetidas a sequenciamento. Os resultados mostraram que N. ceranae e BQCV estão circulando na região sul do país, podendo ser a razão para as perdas de colônias. N. apis não foi encontrado. N. ceranae foi encontrado em 57.6% (53/92) das colônias e BQCV em 32.6% (30/92). Foi encontrada coinfecção por ambos em 25% (23/92) das colônias estudadas, fator que sugere a diminuição da longevidade do hospedeiro por ação sinérgica dos patógenos. As amostras submetidas ao sequenciamento indicaram similaridade de 96.8 a 100% entre elas, além de forte similaridade com sequências da Ásia, Estados Unidos, Alemanha e Peru. Este estudo relata a circulação de N. ceranae e BQCV nos apiários do sul do Brasil, além de ser a primeira análise filogenética da sequência do BQCV brasileiro.(AU)

Recurso polinífero utilizado por Apis mellifera (Himenoptera: Apidae) en un área de bosque subtropical del noroeste de Argentina / Pollen loads used by Apis mellifera (Himenoptera: Apidae) in an area of subtropical forest in Northwestern Argentina

Resumen En el noroeste de Argentina, los bosques subtropicales de las Yungas son de gran importancia por la gran diversidad vegetal. Las abejas melíferas (A. mellifera) utilizan estos recursos para su alimentación y en consecuencia como un servicio ecosistémico a través de la apicultura. La caracterización de la flora polinífera de una región permite conocer la fuente de alimento y definir la importancia de las diferentes especies vegetales para el desarrollo y mantenimiento de las colonias. El objetivo del presente trabajo es identificar la flora polinífera utilizada por A. mellifera en el sector oeste de las Yungas en Jujuy (Argentina) a través de la caracterización de sus cargas corbiculares y analizar las variaciones a lo largo de la primavera y verano de dos periodos productivos consecutivos. Para ello, se analizaron 14 muestras tomadas mensualmente a la largo de los periodos setiembre 2011 a marzo 2012 y setiembre 2012 a marzo de 2013. Las muestras se obtuvieron a través de trampas caza polen en las entradas de las colmenas y tratadas en el laboratorio según las técnicas convencionales de melisopalinología con posterior acetólisis. Se identificaron un total de 46 tipos polínicos pertenecientes a 25 familias botánicas. Las más importantes de acuerdo a los valores de índice de importancia de familia son: Euphorbiaceae (35.54), Fabaceae (26.27), Asteraceae (20.77), Vitaceae (16.14) y Myrtaceae (9.13). Asimismo, los principales recursos poliníferos fueron Eucalyptus, Eupatorium, Mimosa, Parapiptadenia excelsa, Sebastiania, Viguiera, Zanthoxylum, tipo Cissus y representantes de las familias Cactaceae y Euphorbiaceae. Las variaciones del índice de amplitud de nicho trófico evidencian para la zona una selección de recursos florales, donde se destaca la utilización de especies nativas. La información generada en este estudio, aporta al conocimiento del recurso ofrecido por el bosque y las especies que son de importancia para la producción apícola. Además, de contribuir a potenciar la producción y comercialización de este producto a partir de su valor agregado, permitiendo a los apicultores un buen manejo de las colmenas.

Abstract In Northwest Argentina, Yungas subtropical forests are very important because of their huge vegetal diversity. Honeybees (A. mellifera) use these resources to feed and therefore as an ecosystemic service through beekeeping. The characterization of pollen flora of a region allows getting to know the food source and defining the importance of different plant species for colonies development and maintenance. The aim of the present study is to identify the pollen flora used by A. mellifera in the Yungas Western area in Jujuy (Argentina) by means of their pollen loads characterization and to analyze the variations of two consecutive productive periods throughout spring and summer. To do this, 14 samples taken monthly were analyzed over the periods from September 2011 to March 2012 and September 2012 to March 2013. The samples were obtained from pollen traps at the entrances of the hives and were treated in the laboratory under conventional melisopalinology techniques with subsequent acetolysis. A total of 46 pollen types belonging to 25 botanical families were identified. The most important ones according to the family importance index are Euphorbiaceae (35.54), Fabaceae (26.27), Asteraceae (20.77), Vitaceae (16.14), Myrtaceae (9.13). Zanthoxylum, Sebastiania, Mimosa, Euphorbiaceae, Cactaceae, Parapiptadenia excelsa, Eupatorium, Cissus, Eucalyptus y Viguiera were identified as dominant resources. The variations of the breadth Index trophic niche show a floral resources selection for the area, where the use of native species stands out. The information produced in this study contributes to the knowledge of the resource offered by the forest and the species that are important for beekeeping production. Besides, it contributes to enhance the production and marketing of this product from its added value, allowing beekeepers a good management of hives. Rev. Biol. Trop. 66(3): 1182-1196. Epub 2018 September 01.

Analysis of the effects of climate variables on Apis mellifera pollen foraging performance / Análise dos efeitos de variáveis climáticas no desempenho de forrageamento de pólen de abelhas Apis mellifera

Pollination services performed by bees are essential for the reproduction of a great part of flowering plants. The pollen collected by Apis mellifera while performing pollination (bee pollen), has been incorporated into the human diet for its favorable nutritional components. Around 1,500 tons of bee pollen are produced annually worldwide, especially in Spain, China, Australia, Argentina, and Brazil. Despite the importance of bee pollen within apiculture, little is known about the effects of climate variations on bee pollen collection and production. We monitored the pollen collection performance of 24 different honey bee colonies in different climate conditions within a period of one year. We then analyzed the statistical interaction among the number of worker bees returning with pollen loads and 12 climatic variables, to produce a predictive mixed linear model. The results obtained showed that 7 climatic variables were statistically correlated to the pollen collection observed: Maximum temperature of the day, minimum temperature of the day, dew point temperature, relative humidity, cloud cover, rainfall, and the date of the sample. This research brings information for the development of a more effective pollen productive system.(AU)

Serviços de polinização são essenciais para a reprodução de uma grande parte das plantas com flores. Além de fundamental para produtividade agrícola e segurança alimentar no planeta, a atividade de polinização por Apis mellifera também possibilita a produção do pólen apícola. Devido a sua riqueza nutricional, o pólen apícola vem sendo incorporado às dietas humanas e de animais de interesse zootécnico. Cerca de 1.500 toneladas de pólen de abelha são produzidas anualmente em todo o mundo, especialmente em países como Espanha, China, Austrália, Argentina e Brasil. Apesar da importância do pólen na cadeia produtiva apícola, muito pouco se conhece sobre os efeitos das variações climáticas sobre a coleta e a produtividade de pólen. Neste estudo, foi monitorado o desempenho da coleta de pólen de 24 colônias de abelhas africanizadas, em diferentes condições climáticas, por um período de um ano. Analisaram-se estatisticamente as interações dos dados obtidos para o número de abelhas operárias que retornaram com cargas de pólen nas corbículas e 12 variáveis climáticas, a fim de se produzir um modelo estatístico preditivo. Os resultados obtidos mostraram que sete variáveis climáticas influenciaram significativamente a coleta de pólen: temperatura máxima do dia, temperatura mínima do dia, temperatura do ponto de orvalho, umidade relativa, cobertura de nuvens, precipitação pluviométrica e data da amostragem. Esta pesquisa traz informações importantes para o desenvolvimento de um sistema produtivo de pólen apícola mais eficaz.(AU)

Differential performance of honey bee colonies selected for bee-pollen production through instrumental insemination and free-mating technique / Comparação do desempenho de colônias de abelhas melíferas selecionadas para maiores produções de pólen apícola, por meio de inseminação instrumental e acasalamento livre

The use of bee-pollen as a nutritional supplement or as a production-enhancing agent in livestock has increased the demand for this product worldwide. Despite the current importance of this niche within the apiculture industry, few studies have addressed the pollen production. We tested the performance of free-mated (FM) and instrumentally inseminated queens (IQ) in order to establish the effect of different breeding systems on pollen production. The F1 generation of IQ queens produced 153.95±42.83g/day, showing a significant improvement on the pollen production (2.74 times) when compared to the parental generation (51.83±7.84g/day). The F1 generation of free-mated queens produced 100.07±8.23 g/day, which increased by 1.78 times when compared to the parental generation. Furthermore, we observed a statistically significant difference between the pollen production between colonies from the IQ and FM treatments. This study suggests that inseminated queens should be considered by beekeepers that aim to increase pollen production.(AU)

O uso do pólen apícola como suplemento nutricional humano e animal tem aumentado significativamente a demanda por este produto em todo o mundo. Apesar da importância atual desse nicho dentro da apicultura, poucos estudos têm abordado melhorias no sistema produtivo de pólen. Testamos o desempenho de rainhas fecundadas através de acasalamento livre (FM) e inseminação instrumental (QI), a fim de analisar o efeito de diferentes técnicas de melhoramento genético no ganho produtivo de pólen apícola. A geração F1 de rainhas QI produziu 153,95±42,83g de pólen por dia, mostrando uma melhora significativa na produção (2,74 vezes) quando comparado à geração parental (51,83±7,84g/dia). A geração F1 de rainhas de livre acasalamento produziu 100,07±8,23g/dia, o que significou um aumento de 1,78 vezes. Além disso, observou-se uma diferença estatisticamente significativa entre a produção de pólen entre as colônias dos tratamentos QI e FM. Este estudo sugere que a técnica de inseminação instrumental deve ser incorporada nos sistemas produtivos de pólen apícola brasileiro.(AU)

Honey bees (Apis mellifera) visiting flowers of yellow melon (Cucumis melo) using different number of hives / Visita de abelhas melíferas (Apis mellifera) em flores de melão amarelo (Cucumis melo) usando diferente número de colmeias

Honey bees (Apis mellifera) pollinate melon (Cucumis melo) and improve production and quality of fruits. However, little is known about bee behavior and number of hives required. The aims of this study were to compare bees visiting flowers in crop areas with different number of hives (0, 1, 2, and 3), and to evaluate which is the best number. Flowers were observed (n=78) from 5 am to 6 pm, for five consecutive days, in four experimental areas (0.5ha each). Comparisons were made for male (MF) and hermaphrodite (HF) flowers, number of hives and fruit production. The HF were always more visited than MF. Most comparisons made for three hives presented significant differences, since visits increased drastically, competition among bees for floral resources became stronger and reduced the production of commercial fruit (93.4%). On the other hand, the highest percentage of commercial fruit was obtained (99%) with two hives, setting the ideal number of hives as four hives ha-1.

As abelhas melíferas (Apis mellifera) polinizam o melão (Cucumis melo) e melhoram a produção e qualidade dos frutos. Entretanto, pouco é conhecido sobre seu comportamento e o número de colmeias necessário. Os objetivos deste trabalho foram comparar a visitação das abelhas nas flores em áreas de cultivo com diferente número de colmeias (0,1, 2 e 3) e avaliar a produção de frutos em cada situação. Nas quatro áreas experimentais (0,5 ha cada), foram observadas flores (n=78), de 5 às 18h, por cinco dias consecutivos. Foram realizadas comparações para as flores masculinas (FM) e hermafroditas (FH), número de colmeias e produção de frutos. Os resultados mostraram que sempre as FH foram mais visitadas que as FM. A maioria das comparações feitas para três colmeias apresentaram diferenças significativas, já que as visitas aumentaram drasticamente. Provavelmente, a competição entre as abelhas pelos recursos florais foi maior e reduziu a produção de frutos comerciais (93,4%). Por outro lado, com duas colmeias, obteve-se a maior porcentagem de frutos comerciais (99%), indicando que o número ideal é de quatro colmeias ha-1.

Varroa destructor (Mesostigmata: Varroidae) in Costa Rica: population dynamics and its influence on the colony condition of Africanized honey bees (Hymenoptera: Apidae)

The development of Varroa destructor Anderson & Trueman (Mesostigmata: Varroidae) population dynamics in Africanized honey bees, Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) colonies was monitored from February to July 2004 in Atenas, Costa Rica. A correlation between the mite infestation level and the colony condition was evaluated. For each colony, infestation of varroa in adult bees was measured twice a month. Sticky boards were placed on the bottom boards of each colony to collect fallen mites. The condition of the colonies was evaluated by measuring the amount of brood and adult bees. Our results consistently showed that mite infestation on adult bees increased significantly in the experimental colonies, rising to 10.0% by the end of the experiment. In addition, the mean mite fall increased significantly over the course of the study in the treated (R= 0.72, P<0.05) and untreated colonies (R= 0.74, P<0.05) to a level of 63.8 and 73.5 mites per day, respectively. The increase in varroa infestation coincided with a decrease in the amount of brood. Furthermore, adult bees with deformed wings or even without wings crawling in front of their hive occurred in highly infested colonies (mite infestation = 10.0% or more). Rev. Biol. Trop. 56 (4): 1741-1747. Epub 2008 December 12.

La dinámica poblacional del ácaro Varroa destructor Anderson & Trueman (Mesostigmata: Varroidae) en abejas africanizadas, Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) fue monitoreada de febrero a julio 2004, en Atenas, Costa Rica. Asimismo, se analizó la relación entre el nivel de infestación de varroa y la condición de la colmena. La infestación del ácaro V. destructor fue evaluada en abejas adultas dos veces al mes. Además, se colocaron trampas adhesivas en el fondo de la colmena para recoger los ácaros que caen naturalmente. La condición de la colmena fue determinada midiendo la cantidad de cría y la población de abejas adultas. La infestación del ácaro V. destructor en abejas adultas aumentó significativamente durante el estudio hasta alcanzar un 10.0%. Igualmente, la caída natural de ácaros se incrementó, tanto en colmenas que fueron tratadas previa-mente con un acaricida químico (R= 0.72, P<0.05) como en colmenas sin tratamiento (R= 0.74, P<0.05), hasta llegar a 63.8 y 73.5 ácaros por día, respectivamente. El aumento de la infestación en las colmenas coincidió con una disminución en la cantidad de cría. La presencia de abejas adultas con alas deformes o sin alas, arrastrándose en frente de la colmena, fue observada en colmenas altamente infestadas con el ácaro de la varroa (infestación superior = 10.0%).