Asynchrony between in vivo and in vitro rabbit embryos

Background: Comparative features of embryos developed under in vitro and in vivo conditions are particularly important in designing embryo transfer procedures that fulfil embryo-recipient synchronization requirements. Objective: To determine the degree of asynchrony in rabbit embryo development between cultured and in vivo embryos. Methods: A total of 55 non- lactating multiparous female rabbits were used. Embryos were classified as 16-cells or early morulae at 48 hours post-coitum (hpc). Embryos were cultured during 30 or 32 h and embryo development was compared with in vivo embryos of 72 hpc. In vitro and in vivo embryos at 72 hpc were classified as early or compacted morulae. Bayesian statistics was used. Difference between in vivo and in vitro embryos and the actual probability of the difference between the in vivo and in vitro embryo higher than zero (P) was estimated. Results: The percentage of compacted morulae was higher in in vivo embryos than in in vitro embryos with +6 h of asynchrony (73.5 and 32.8%, P=1.00). But the percentage of compacted morulae was similar with +8 h asynchrony. Conclusions: In vitro embryos delay their development by + 8 hours compared to in vivo embryos.

Antecedentes: El desarrollo comparativo de embriones producidos in vitro e in vivo es particularmente importante para el diseño de procedimientos de transferencia de embriones cuando se requiere sincronización entre el embrión y la hembra receptora. Objetivo: Determinar el grado de asincronía en el desarrollo embrionario entre embriones in vivo y cultivados. Métodos: Un total de 55 conejas multiparas no lactantes fueron utilizadas. Los embriones se clasificaron en 16 células o mórulas tempranas a las 48 horas después del coito (hpc). Los embriones se cultivaron durante 30 ó 32 horas y el desarrollo embrionario se comparó con embriones de 72 hpc obtenidos in vivo. Los embriones in vitro e in vivo a 72 hpc se clasificaron como mórulas tempranas o compactas. Se utilizó estadística bayesiana. Se estimó la diferencia entre embriones in vivo e in vitro y la probabilidad de que la diferencia sea superior a cero (P). Resultados: El porcentaje de mórulas compactas fue mayor en embriones in vivo que en embriones in vitro con +6 horas de asincronía (73,5 y 32,8%, P=1,00), pero el porcentaje de mórulas compactas fue similar con asincronía de +8 horas. Conclusión: Los embriones cultivados retrasan +8 horas su desarrollo en comparación con los embriones in vivo.

Antecedentes: A aquisição do desenvolvimento de embriões produzidos in vitro e in vivo é particularmente importante na concepção de procedimentos de transferência de embriões em que a sincronização entre o embrião e a fêmea receptora é necessária. Objetivo: Determinar o grau de assincronia no desenvolvimento embrionário entre embriões cultivados e in vivo. Métodos: Um total de 55 coelhos multíparos não lactantes foram usados. Os embriões foram classificados em 16 células ou mórulas iniciais 48 horas de gestação (hpc). Os embriões foram cultivados por 30 ou 32 horas e o desenvolvimento embrionário foi comparado com embriões de 72 hpc obtidos in vivo. Embriões in vitro e in vivo a 72 hpc foram classificados como mórulas precoces ou compactadas. Estatísticas bayesianas foram usadas. A diferença entre embriões in vivo e in vitro e a probabilidade de que a diferença seja maior que zero (P) foi estimada. Resultados: A porcentagem de mórulas compactadas foi maior em embriões in vivo do que em embriões in vitro com +6 horas de assincronia (73,5 e 32,8%, P=1,00). Mas a porcentagem de mórulas compactadas foi semelhante com assincronia de +8 horas. Conclusão: Embriões cultivados atrasam seu desenvolvimento em +8 horas em comparação com embriões in vivo.

Well-of-the-well (WOW) versus polyester mesh (PM): a comparison of single-embryo culture systems in bovines

Background: Mexico is innovating in the livestock industry through in vitro generation of bovine embryos with technologies such as well-of-the-well (WOW) and polyester mesh (PM) single-embryo culture systems. These techniques allow to maintain embryos in separate areas of a shared culture medium. Objective: To compare the quantity and quality of bovine embryos produced in WOW and PM culture systems versus the conventional (CG) culture system. Methods: In total, 345 embryos fertilized in vitro were evaluated for blastocyst yield in the three culture systems. To count blastocyst cell numbers, 69 embryos in each system were differentially stained for trophectoderm (TE), inner cell mass (ICM), and apoptotic cells. A qPCR gene expression analysis was performed for embryos in all three systems. Results: The WOW, PM and CG systems developed similar amount of blastocysts (41, 35 and 36%, respectively; p>0.05). Blastocysts in all three systems showed adequate amounts of ICM and apoptotic cells. Blastocysts in the PM system showed a greater number of TE cells [63.7 versus 58.6% in the CG system (p0.05). The ATP5B expression was higher in WOW than in PM (p0.05). The TJP3 expression was higher in PM than in WOW and CG (p<0.05). Expression of ID2 and CLDN4 was higher in WOW than in PM and CG (p<0.05). The biplot graphic from Principal Component Analysis (PCA) revealed that CG was located near degenerated embryos, whereas PM was located near arrested embryos, larger ICM and TE, and TJP3 expression. The WOW was located toward blastocysts, morulae, and expression of CLDN4, ID2 and GNAS. Conclusion: Compared with CG, both the PM and WOW systems are good options for culturing single embryos in the bovine model. Moreover, the PCA results suggest that embryos developed in the WOW system have greater capacity for generating blastocysts with increased ability to form TE and ICM layers, which might improve implantation.

Antecedentes: México está innovando en la industria ganadera a través de la generación in vitro de embriones bovinos con tecnologías de cultivo individual como lo son Pozo dentro de Pozo (WOW) y Malla de Poliéster (PM). Estos mantienen los embriones en áreas separadas mientras comparten un mismo medio de cultivo celular. Objetivo: Comparar la cantidad y calidad de embriones bovinos producidos en los sistemas WOW y PM contra el sistema de cultivo convencional en grupo (CG). Métodos: En total se evaluaron 345 embriones fertilizados in vitro para determinar la producción de blastocistos generados en los tres sistemas. Para contar el número de células por blastocisto, 69 embriones en cada sistema se tiñeron diferencialmente para trofectodermo (TE), masa celular interna (ICM) y células apoptóticas. Se realizó un análisis de expresión génica por qPCR de los embriones obtenidos en los tres sistemas. Resultados: Los sistemas WOW, PM y CG desarrollaron similares cantidades de blastocistos (41, 35 y 36%, respectivamente; p>0,05). Los blastocistos en los tres sistemas mostraron cantidades adecuadas de ICM y células apoptóticas. Los blastocistos en el sistema PM mostraron un mayor número de células TE [63,7% versus 58,6% en el sistema CG (p0,05). La expresión de ATP5B fue mayor en WOW que en PM (p<0,05), pero similar a CG (p<0,05). La expresión de TJP3 fue mayor en PM que en WOW y CG (p<0,05). La expresión de ID2 y CLDN4 fue mayor en WOW que en PM y CG (p<0,05). El gráfico de biplot del análisis de componentes principales reveló que CG se encontró cerca de embriones degenerados, mientras que PM se encontró cerca de embriones en arresto, ICM, TE, y TJP3. El WOW se localizó hacia blastocistos, mórulas y la expresión de CLDN4, ID2 y GNAS. Conclusión: En el modelo bovino los sistemas PM y WOW son buenas opciones para cultivar embriones individuales, ya que se obtienen resultados muy similares a los obtenidos con el sistema CG. Además, los resultados de PCA sugieren que los embriones individuales desarrollados en el sistema WOW generan blastocistos con mayor capacidad de formar TE e ICM, lo que podría mejorar su éxito de implantación.

Antecedentes: O México está inovando na indústria pecuária por meio da geração in vitro de embriões bovinos com tecnologias de cultura de embriões individuais, bem como em poço (WOW) e malha de poliéster (PM). Estes mantêm os embriões em áreas separadas, enquanto compartilham o mesmo meio de cultura de células. Objetivo: Comparar a quantidade e a qualidade de embriões bovinos produzidos nos sistemas de cultura WOW e PM com o sistema convencional de cultura em grupo (CG). Métodos: No total, 345 embriões fertilizados in vitro foram avaliados para determinar a produção de blastocistos gerados nos três sistemas. O número de células por blatocisto foi contado, 69 embriões em cada sistema foram diferencialmente corados para trofectoderme (TE), massa celular interna (ICM) e células apoptóticas. Uma análise de expressão gênica qPCR foi realizada para os embriões obtidos nos três sistemas. Resultados: Os sistemas WOW, PM e CG desenvolveram quantidades semelhantes de blastocistos (41, 35 e 36%, respectivamente; p>0,05). Os blastocistos nos três sistemas mostraram quantidades adequadas de ICM e células apoptóticas. Os blastocistos no sistema PM mostraram um número maior de células TE [63,7 versus 58,6% no sistema CG (p0,05). A expressão de ATP5B foi maior no WOW do que no PM (p<0,05), mas semelhante ao GC (p<0,05). A expressão de TJP3 foi maior no PM do que no WOW e CG (p<0,05). A expressão de ID2 e CLDN4 foi maior no WOW do que no PM e CG (p<0,05). O gráfico biplot da análise de componentes principais revelou que CG foi encontrado próximo a embriões degenerados, enquanto PM foi encontrado próximo a embriões presos, ICM, TE e TJP3. WOW foi encontrado para ter blastocistos, mórulas e a expressão de CLDN4, ID2 e GNAS. Conclusão: Em comparação com o CG, os sistemas PM e WOW são boas opções para a cultura de embriões individuais no modelo bovino. Além disso, os resultados da PCA sugerem que embriões individuais desenvolvidos no sistema WOW têm maior capacidade de desenvolver blastocistos com maior capacidade de formar as camadas TE e ICM, o que poderia melhorar seu sucesso de implantação.

Influence of different protein supplements on the recovery and in vitro maturation of bovine oocytes / Influencia de diferentes suplementos proteicos en la recuperación y maduración in vitro de ovocitos bovinos / Influência de diferentes suplementações proteicas sobre a recuperação e maturação in vitro de oócitos bovinos

Abstract Background: Oocyte quality and maturation are influenced by protein supplementation. Objective: To evaluate the influence of fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) concentrations on the recovery and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. Methods: The study was divided into Stage 1 (oocyte recovery), and Stage 2 (IVM). In the first stage, three experiments were conducted according to the recovery (R) medium used: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; and (R3) the best results from R1, R2, and the combination of FBS+BSA (5+5%). Within the second stage, the maturation medium was supplemented according to three experiments: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0.4 vs. 0.8% BSA; and (M3) better results of M1, M2, and the combination of FBS+BSA (5+0.8%). Results: In Stage 1 (R1 and R2), the media with 10% FBS and 10% BSA showed better oocyte quality results and were defined for experiment R3. In R3, the 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) allowed recovery of better-quality oocytes. In Stage 2 (M1 and M2), media with both levels of FBS (5 and 10%) and 0.8% BSA were defined as better according to the maturation and viability rates of cumulus cells, so they were defined for experiment M3. In M3, no difference was noted among the supplements. Conclusions: For oocyte recovery, 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) can be used to obtain immature oocytes. For the in vitro maturation, FBS (both levels, 5 and 10%) and BSA (0.8%) can be used alone or in combination.

Resumen Antecedentes: La calidad y maduración de los ovocitos son influenciados por la suplementación proteica. Objetivo: Evaluar la influencia de concentraciones de suero fetal bovino (FBS) y albúmina sérica bovina (BSA) en la recuperación y maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos. Métodos: El estudio se dividió en Etapa 1 (recuperación de ovocitos) y Etapa 2 (IVM). En la primera etapa, tres experimentos se realizaron de acuerdo con el medio de recuperación: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; y (R3) los mejores resultados de R1, R2 y la combinación de FBS+BSA (5+5%). En la segunda etapa, el medio de maduración fue suplementado para tres experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; y (M3) mejores resultados de M1, M2 y la combinación de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: En la Etapa 1 (R1 y R2), los medios con 10% FBS y 10% BSA mostraron mejores resultados de calidad oocitaria y fueron definidos para el experimento R3. En R3, 10% FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) permitieron la recuperación de ovocitos de mejor calidad. En la Etapa 2 (M1 y M2), los medios con ambos niveles de FBS (5 y 10%) y 0,8% de BSA se definieron como mejores de acuerdo con las tasas de maduración y viabilidad de las células del cumulus, por lo que se definieron para el experimento M3. En M3, no se observó diferencia entre los suplementos. Conclusiones: Para la recuperación de ovocitos, se puede utilizar 10% de FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) para obtener ovocitos inmaduros. Para la maduración in vitro, FBS (ambos niveles, 5 y 10%) y BSA (0,8%) se pueden usar solos o en combinación.

Resumo Antecedentes: A qualidade e a maturação de oócitos são influenciadas pela suplementação proteica. Objetivo: Avaliar a influência de concentrações de soro fetal bovino (FBS) e albumina sérica bovina (BSA) sobre a recuperação e maturação in vitro (IVM) de oócitos bovinos. Métodos: O estudo foi dividido em Etapa 1 (recuperação de oócitos) e Etapa 2 (IVM). Na primeira etapa, três experimentos foram realizados de acordo com o meio de recuperação: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; e (R3) melhores resultados de R1, R2 e a combinação de FBS+BSA (5+5%). Na segunda etapa, o meio de maturação foi suplementado de acordo com três experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; e (M3) melhores resultados de M1, M2 e a combinação de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: Na Etapa 1 (R1 e R2), os meios com 10% FBS e 10% BSA mostraram melhores resultados de qualidade oocitária e foram definidos para o experimento R3. Em R3, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) permitiram a recuperação de oócitos de melhor qualidade. Na segunda etapa (M1 e M2), meios com ambos os níveis de FBS (5 e 10%) e 0,8% BSA foram definidos como os melhores de acordo com as taxas de maturação e viabilidade de células do cumulus, então foram definidos para o experimento M3. No M3, não houve diferença entre os suplementos. Conclusões: Para a recuperação oocitária, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) podem ser usados para obter oócitos imaturos. Para maturação in vitro, FBS (ambos os níveis, 5 e 10%) e BSA (0,8%) podem ser usados sozinhos ou em combinação.

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

Maturation timing and fetal bovine serum concentration for developmental potential of sheep oocytes in vitro.

The success of in vitro embryo production (IVEP) in animals has improved over time, employing a variety of culture media. Here, we assessed the maturation timing and developmental potential of sheep oocytes in vitro at different concentrations of fetal bovine serum (FBS). Cumulus oocyte complexes (COCs) were aspirated from follicles (2-6 mm) of sheep ovaries collected from local slaughter house. COCs were randomly divided into two groups and matured at 38.5°C, 5% CO2 for 24 h (Group I) and 27 h (Group II). Oocytes cultured for 27 h showed significantly (P <0.05) more maturation than those cultured for 24 h (82 vs. 76%) followed by more cleavage (35 vs. 30%), morula (53 vs. 39%) and blastocyst (17 vs. 11%) percentage. In the second experiment, oocytes were randomly divided into two groups and matured with 10% FBS (Group I) and 20% FBS (Group II) for 27 h supplemented with pyruvate, glutamine, LH, FSH and estradiol. After maturation, oocytes were fertilized by fresh semen for 18 h. Presumptive zygotes in both the groups were again divided into two groups and cultured in 10 and 20% FBS during post fertilization period, respectively. Different FBS concentration in maturation medium did not influence maturation percentage (82 vs. 79%) significantly. Out of culture groups, presumptive zygotes matured in 20% FBS and cultured in 20% FBS during post fertilization period showed significant increase in cleavage percentage (44 vs. 39, 35 and 27%) as compared to other groups but subsequent development to morula (55 vs. 53, 43 and 40%) and blastocyst (20 vs. 17, 16 and 15%) percentage were more in the group matured in 10% FBS and cultured in 20% FBS during post fertilization period.

Influence of Dominant Follicle and Corpus luteum on Recovery of Good Quality Oocytes for In vitro Embryo Production in Cattle.

The quality of oocytes is more critical for the success of bovine in vitro embryo production (IVP) than the conditions of in vitro culture of these structures. Despite knowledge about bovine follicular development, especially gonadotropin-dependent phase, be considerably wide, knowledge about effects of the estrous cycle phase, follicular or luteal, on recovery of oocytes may strongly contribute to improve IVP efficiency. Previous efforts to find the proper cumulus-oocyte complex (COC) in vitro maturation conditions did not improve this technique at level of the in vivo embryo production. In physiological conditions the oocyte to be fertilized is donated by healthy follicles during a specific stage of the estrous cycle. However, COCs collected for IVP are obtained from follicles disregarding the follicular phase; consequently, they may have been subjected to different levels of estradiol, progesterone, FSH and LH. Plasma progesterone affects oocyte quality probably because it allows the follicle is exposed for a long period to low amplitude LH pulses, resulting in good quality oocyte. Besides, the presence of a functional corpus luteum (CL) in the ovary may interfere with the amount and quality of oocytes, CL is related to a high vascularization of the ovary which can propitiate an optimal hormonal and nutritional environment for developing follicles. Moreover, the developmental ability of oocytes from small follicles can be influenced by a presence of dominant follicle. Therefore, the ovarian condition of regularly cyclic females needs to be a concern in collection of oocytes for commercial IVP.

Fatores que interferem na eficiência reprodutiva de receptoras de embrião bovino / Fators affecting the reproductive efficiency of bovine embryo recipients / Factores que interfieren en la eficacia reproductiva de receptoras de emvriones bovinos

As receptoras de embriões utilizadas no Brasil, normalmente, são animais mestiços (Bos taurus x Bos indicus), o que as tornam mais susceptíveis às variações ambientais devido ao componente genético taurino. O objetivo dessa revisão é identificar os fatores intrínsecos (corpo lúteo, progesterona, sincronia doadora vs. receptora, protocolos de sincronização, qualidade do embrião, dificuldade na inovulação e ordem da inovulação) e os extrínsecos (nutricionais, manejo e ambiente, raça e categoria animal) que interferem na eficiência reprodutiva das receptoras de embrião. As receptoras precisam estar aptas a receberem o embrião no dia da inovulação, para assim levar a gestação a termo. O manejo nutricional deve ser um aliado, mantendo o escore de condição corporal da receptora sempre adequada entre 2,75 a 4 (escala de 1 a 5). O manejo dos animais deve ter uma visão multidisciplinar, observando as possibilidades de minimizar o estresse sofrido pelas fêmeas, de acordo com as condições de cada propriedade. O estresse térmico por calor interfere nos resultados dos programas de transferência de embrião. Medidas simples como manter as receptoras em ambiente sombreado, com água e comida enquanto aguardam a inovulação podem melhorar a taxa de prenhez. A transferência deve ser feita de preferência nos horários de clima mais ameno.

The embryo recipients utilized in Brazil are often crossbred (Bos taurus x Bos indicus), making them more susceptible to climatic variations due to the taurean genetic component. The aim of this review is to identify the intrinsic factors (corpus luteum, progesterone, synchronization between donor and recipient, synchronization protocols, embryo quality,difficulty in inovulation and inovulation order) as well as extrinsic factors (nutritional, handling and environment, breed and animal category) affecting the reproductive efficiency of embryo recipients. The recipients need to be ready to receive theembryo on the inovulation day in order to carry pregnancies to term. Nutritional management can be an ally, maintaining the body condition score of the recipients always adequate, between 2.75 and 4 (in a range from 1-5). The handling of animals must have a multidisciplinary approach, verifying the possible opportunities to minimize the stress experienced by females, according to the conditions of each property. The heat stress interferes in the results of embryo transfer programs. Simple actions such as keeping the recipients under shade, with food and water while waiting for inovulation might improve the pregnancy rate. The transfer must be made preferably during the cooler periods of the day. KEYWORDS: Bovine. In vitro embryo production. Animal reproduction. Pregnancy rates.

Las receptoras de embriones, utilizadas en Brasil, normalmente, son animales mestizos (Bos taurus x Bos indicus), lo que las hacen más susceptibles a las variaciones ambientales debido al componente genético taurino. El objetivo de esta revisión es identificar los factores intrínsecos (cuerpo lúteo, progesterona, sincronía donante vs. receptora, protocolos de sincronización, calidad del embrión, dificultad en la inovulación y orden de la inovulación) y los extrínsecos (nutricionales, manejo, ambiente, raza y categoría animal), que interfieren en la eficacia reproductiva de las receptoras de embrión. Las receptoras necesitan estar aptas a recibir el embrión en el día de la inovulación, para llevar el embarazo a término. El manejo nutricional debe ser un aliado, manteniendo el escore de condición corporal de la receptora, siempre adecuado entre 2,75 a 4 (escala de 1 a 5). El manejo de los animales debe tener una visión multidisciplinar, observando las posibilidades de minimizar el estrés sufrido por las hembras, de acuerdo con las condiciones de cada propiedad. El estrés térmico, por calor, interfiere en los resultados de los programas de transferencia de embrión. Medidas sencillas como mantener las receptoras en ambiente con sombra, agua y comida, mientras aguardan la inovulación, pueden mejorar la taza de preñez. La transferencia debe ser hecha, de preferencia, en los horarios de clima más ameno.

Efecto del estatus reproductivo de vacas mestizas cebú sobre la producción In Vitro de embriones / Effect of the Reproductive Status of Crossbred Zebu Cows on In Vitro Embryo Production

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del estatus reproductivo (gestantes versus vacías) de hembras mestizas Cebú postmortem sobre el número de ovocitos recuperados, la tasa de división embrionaria y la tasa de producción de blastocitos. Los complejos cúmulo ovocito (CCO) recolectados a través del tasajeo de los ovarios, fueron seleccionados, contados y separados por grupo en: hembras gestantes (ovarios con o sin cuerpo lúteo [CL]) y hembras vacías (ovarios con o sin CL). El número de CCO recuperados fue analizado utilizando el procedimiento GENMOD, asumiendo una distribución de Poisson, mientras que los datos de división y producción de blastocitos fueron analizados utilizando una regresión logística asumiendo una distribución binomial. Se evaluó un total de 4658 CCO obtenidos de 437 ovarios, siendo significativamente mayor (p<0,03), el número de CCO obtenidos de ovarios procedentes de vacas gestantes (12,5±2,8), comparado con el número de CCO provenientes de ovarios de hembras vacías (9,4±2,5). La tasa de división embrionaria, fue significativamente mayor (p<0,006) para el grupo de hembras vacías (42,3±0,01%) con respecto a las gestantes (34,5±0,02); asimismo, la interacción estatus reproductivo por CL afectó (p<0,006) la tasa de división embrionaria: vacas gestantes con CL (Gest-CL) y vacas gestantes sin CL (Gest-NoCL; 31,1±0,02% [76/244] vs. 38,0±0,03% [98/258], respectivamente) y vacas vacías con CL (Va-CL) y vacas vacías sin CL (Va-NoCL; 46,7±0,03% [312/738] vs. 38,0±0,03% [143/376], respectivamente). No hubo diferencia significativa en la tasa de producción de blastocitos a partir de embriones divididos de hembras gestantes (10,7±0,02%; 17/160) comparado con el grupo de hembras vacías (10,0±0,02%; 30/312). Estos resultados indican que la selección de los CCO, con base en el estatus reproductivo de la hembra bovina, es un aspecto importante a tomar en cuenta para mejorar la producción de embriones in vitro.

In order to improve the oocyte selection for in vitro embryo production, the present work evaluated the effect of the reproductive status of postmortem Crossbred Zebu cows (pregnant [P] versus non-pregnant [NP]) on the number of recovered oocytes, the cleavage (number of cleaved embryos/number of recovered oocytes) and the blastocyst production (number of blastocyst/number of cleaved embryos) rates. Cumulus oocytes complexes (CCOs) were selected, counted and separated depending on the donor status: P cows with or without a corpus luteum (CL) and NP cows with (CL) or without (NoCL) a CL. Data for number of recovered oocytes was analyzed using the GENMOD procedure assuming a Poisson distribution, whereas data for cleavage and blastocyst production rates were analyzed using a logistic regression assuming a binomial distribution. The statistical model for all the analyses included the effects of the reproductive status (P vs. NP), presence or not of a CL (CL vs. NoCL) and the interaction of reproductive status x CL. A total of 4658 CCOs obtained from 437 ovaries was evaluated. The number of CCOs collected per ovary from P cows (12.5±2.8) was significantly higher (p<0.03) than from NP cows (9.4±2.5). On the other hand, the cleavage rate was significantly higher (p<0.006) in NoP cows (42.3+0.01%) than in P cows (34.5+0.02). Nevertheless, the interaction between reproductive status and CL affected (p<0.006) the cleavage rate: P-CL: 31.1+0.02% (76/244); P-NoCL: 38.0+0.03% (98/258); NoP-CL: 46.7+0.03% (312/738) and NoP-NoCL: 38.0+0.03% (143/376). There were not differences in blastocyst production rate from cleaved embryos for P cows (10.7+0.02%; 17/160) compared with NoP cows (10.0+0.02%; 30/312). These results show that the reproductive status of a cow should be taken into account for oocyte selection, in order to improve embryo production.

Efecto de la edad y la hora de la aspiración sobre la calidad oocitaria y el desarrollo in vitro en hembras bovinas prepúberes / Effect of age and coasting period on oocytes quality and their in vitro development from prepubertal cattle

Objective. This study evaluated the effect of age and coasting period over oocyte quality and their posterior development under in vitro conditions from prepubertal Bos indicus crossbred donors. Material and methods. Donors females received a norgestomet implant and estradiol benzoate. Four days later a unique dosage of 150 IU of eCG was administered. Three coasting periods (24, 48, and 56 h) and four ages (3, 6, 10, and 12 months) were proved. All antral follicles were aspirated and an in vitro culture proceed was done. Results. 439 follicles were aspirated, of which 385 (87.7%) were 2-5 mm, 41 (9.33%) were 5-10 mm, and 13 (2.3%) were ›10 mm. After aspiration, a total of 373 oocytes (84.9%) were recovered, finding differences (p<0.05) between averages of 6 (9.3) and 10 months old animals (32.3). 285 (76.4 %) recovered oocytes were subjected to in vitro process. Cleavage values were significantly higher (p<0.05) in 10 (27.1%) and 12 months animals (26.8%). Although the number of transferable embryos was low, there were differences between ages (p<0.05) obtaining a higher percentage in age 3 (12.6%). Conclusions. A coasting period higher than 24 h has a negative effect on oocyte quality. Some oocytes from 3 months old calves were competent for in vitro embryo development; however, higher numbers of embryos were produced from 10 and 12 months of age prepuber females, indicating they have higher competency in vitro.

Maturação e desenvolvimento embrionário in vitro de oócitos bovinos após bloqueio da meiose com inibidores de MPF / In vitro maturation and embryo development of bovine oocytes after meiosis blockage with MPF inhibitors

O objetivo deste estudo foi avaliar a maturação e o desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro de oócitos bovinos que tiveram a maturação bloqueada com Butirolactona I e Roscovitina em meio de pré-maturação suplementado com soro fetal bovino (SFB). Oócitos foram divididos em 4 grupos: Controle 0 hora, Controle (maturação por 24 horas), Butirolactona I (bloqueio da maturação com 150μM de Butirolactona I por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação) e Roscovitina (bloqueio da maturação com 50μM de Roscovitina por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação). Para avaliar a maturação nuclear, os oócitos foram fixados e corados em aceto orceína. Parte dos oócitos dos grupos Controle 24 horas, Roscovitina e Butirolactona I após o período de maturação, foi fecundado in vitro. O desenvolvimento embrionário foi avaliado pelos índices de clivagem (D3) e formação de blastocistos (D7). Oócitos do grupo Butirolactona I apresentaram índices de Vesícula Germinativa após o bloqueio e de Metáfase 2 após a maturação semelhantes ao dos grupos Controle 0 hora e Controle, respectivamente. Por outro lado, a Roscovitina apresentou menores índices de Vesícula Germinativa e Metáfase 2. Os grupos Controle e Butirolactona I apresentaram maiores índices de clivagens. O grupo Controle apresentou maior produção de blastocistos que o Roscovitina e não diferiu do grupo Butirolactona I. Conclui-se que a Butiroloactona I pode ser utilizada no sistema de pré-maturação em meio contendo SFB, pois apresentou resultados semelhantes ao do grupo Controle o mesmo não ocorrendo com a Roscovitina, que apresentou menores índices de maturação oocitária e de desenvolvimento embrionário.

This study evaluated the bovine oocyte maturation and embryo development after in vitro fertilization. The maturation of the oocytes was blocked using Butyrolactone I and Roscovitine using pre-maturation medium supplemented with fetal calf serum (FCS). The ocytes were divided in four groups: Control 0 hour, Control (24 hours of maturation), Roscovitine (maturation blockage with 50mM Roscovitine during 24 hours followed by 24 hours of maturation), and Butyrolactone I (maturation blockage with 150mM Butyrolactone I during 24 hours followed by 24 hours of maturation). The oocytes were fixed and stained with aceto orcein to evaluate the nuclear maturation. After the maturation period, the remaining oocytes of the Control group, Roscovitine, and Butyrolactone I were fertilized in vitro. Embryo development was assessed by the cleavage rate (D3) and blastocysts formation (D7). The Butyrolactone I group had similar rates of germinal vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation, comparing to Control group at 0 hour and Control group, respectively. On the other hand, the Roscovitine group had lower rates of vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation comparing to Control groups. After in vitro fertilization, higher rates of cleavage were observed in Control and Butyrolactone I groups. For the blastocyst formation rate, the Control group showed better results than Roscovitine group. In summary, Butyrolactone I group had similar results to the Control group, and for this reason, is suitable for pre-maturation of bovine oocytes using FCS. In contrast, Roscovitine group had lower oocyte maturation and embryo development.

Factors that affect the in vitro production of bovine embryos. A review / Factores que afectan la producción in vitro de embriones bovinos: una revisión / Fatores que afetam a produção in vitro de embriões bovinos. A revisão

In vitro embryo production (IVP) represents a way to increase gamete use from animals with high zootechnical value. In spite of the advances obtained in IVP over the last few years, production of transferable embryos is still low. The aim of this review is to discuss ways to produce in vitro embryos, as well as oocytes formation and maturation processes that can be related to the effectiveness of obtained results. Some studies show the influence of follicular growth factors, gonadotropins, steroids and other hormones on the follicular development and the quality of the cumulus oocyte complex (COC). The follicular phase of slow growth is critical for the development of the oocyte capacity to reach the final competence and diameter. Information about endocrine influences, or likewise, the dependence of growth of small antral follicles when a loss in the oocyte or follicle functionality occurs is scarce in the literature. A variable number of different techniques and protocols for treatment of oocytes donors are described with the aim of improve the results, the COCs recovering rate and the developmental competence in vitro of collected oocytes. From the considerations presented in this review, it is possible to verify the importance of better understanding the factors involved in the IVP process, with the aim of allow new alternatives to increase the results obtained in programs of animal assisted reproduction.

La producción in vitro de embriones (PIV) representa una manera de aumentar el uso de gametos de animales con alto valor zootécnico. A pesar de los avances obtenidos en PIV en los últimos años, la producción de embriones tranferibles sigue siendo baja. El objetivo de esta revisión es discutir maneras de producir embriones in vitro, así como los procesos de formación y de maduración de los oocitos que se pueden relacionar con la eficacia de los resultados obtenidos. Algunos estudios demuestran la influencia de los factores foliculares del crecimiento, gonadotrofinas, esteroides y otras hormonas en el desarrollo folicular y la calidad del complejo del cumulus oocito (CCO). La fase folicular del crecimiento lento es crítica para el desarrollo de la capacidad del oocito de alcanzar la capacidad y el diámetro final. Información sobre influencias endocrinas, o además, la dependencia del crecimiento de pequeños folículos antrales cuando ocurre una pérdida en la funcionalidad del oocito o del folículo, es escasa en la literatura. Un número variable de diversas técnicas y los protocolos para el tratamiento de oocitos de las donantes son descritos en esta revisión, con lo objetivo de mejorar los resultados, el índice de la recuperacion de CCOs y la capacidad de desarrollo in vitro de oocitos recogidos. De las consideraciones presentadas en esta revisión, es posible verificar la importancia de entender los factores implicados en el proceso de PIV, para permitir el desarrollo de nuevas alternativas que mejoren los resultados obtenidos en programas de la reproducción animal asistida.

A produção in vitro (PIV) de embriões representa uma maneira de incrementar o uso de gametas de animais de alto valor zootécnico. Apesar dos avanços obtidos na PIV nos últimos anos, a produção de embriões transferíveis ainda é baixa. O objetivo desta revisão é discutir maneiras de produzir embriões in vitro, assim como o processo de formação e maturação de oócitos, que pode estar relacionado a eficácia dos resultados obtidos. Aguns estudos demonstram a influência de fatores de crescimento, gonadotrofinas, esteróides e outros hormônios no desenvolvimento folicular e na qualidade do complexo cumulus oócito (CCO). A fase folicular de crescimento lento é critica para o desenvolvimento da capacidade do oócito de atingir a competência e o diâmetro finais. Informação sobre as influências endócrinas, ou seja, da dependência do crescimento de pequenos folículos antrais quando ocorre perda da funcionalidade do oócito ou folículo são escassas na literatura. Um número variável de diferentes técnicas e protocolos para o tratamento de doadoras de ovóctios são descritos com o objetivo de melhorar os resultados, a taxa de recuperação de CCOs e o desenvolvimento da competência in vitro dos oócitos coletados. Das considerações apresentadas nesta revisão é possível verificar a importância do conhecimento dos fatores envolvidos no processo de PIV, com o objetivo de possibilitar que novas alternativas incrementem os resultados obtidos em programas de reprodução animal assistida.