Oxidative stress and changes in the content and pattern of tissue expression of ß-catenin protein in diversion colitis

OBJECTIVE: The aim of this study is to verify if oxidative stress is related to changes in content and pattern of β-catenin protein expression in an experimental model of diversion colitis. METHODS: Sixty Wistar rats were submitted to intestinal bypass. The animals were divided into three groups according to the sacrifice to take place in six, 12 and 18 weeks. For each group, five animals only underwent laparotomy (control). The presence of colitis was diagnosed by histological study, and its severity, by inflammation grading scale. Cellular oxidative stress was measured by comet assay. Tissue expression of β-catenin protein was analyzed by the immunohistochemistry and quantification of its tissue content by computerized morphometry. Statistical analysis was performed with the Student's t-test, median, Mann-Whitney, ANOVA and Kruskal-Wallis, adopting a significance level of 5% (p <0.05). RESULTS: Colon segments without fecal stream developed colitis, which worsened with time of exclusion. Segments without fecal stream suffer higher levels of oxidative stress when compared to those with stream, and it worsens with time of exclusion. The levels of cellular oxidative stress are directly related to the degree of inflammation. The total content of ß-catenin in segments without fecal stream reduces after six weeks, and does not vary thereafter. The content of β-catenin in the apical portion of the colon crypts decreases with time, whereas in the basal region, it increases. The total content of ß-catenin is inversely related to the degree of inflammation and levels of tissue oxidative stress levels. CONCLUSION: There are changes in tissue content of E-cadherin and increased expression of ß-catenin in proliferative regions of colonic crypts, related with oxidative tissue stress. (AU)

OBJETIVO: O objetivo do presente estudo é avaliar a relação entre estresse oxidativo e conteúdo tecidual de β-catenina em modelo experimental de colite de exclusão. MÉTODOS: Sessenta ratos Wistar foram submetidos à derivação intestinal e divididos em três grupos experimentais segundo o sacrifício ser realizado em 6, 12 e 18 semanas. Para cada grupo, cinco animais foram submetidos apenas a laparotomia (controle). A colite foi diagnosticada por estudo histológico, enquanto sua intensidade por escala de graduação inflamatória. Os níveis de estresse oxidativo foram mensurados pelo ensaio cometa, enquanto a expressão e o conteúdo tecidual de ß-catenina por imunoistoquímica e morfometria computadorizada, respectivamente. Os resultados foram analisados pelos testes t de Student, Mann Whitney, ANOVA e Kruskal-Wallis, estabelecendo-se nível de significância de 5% (p<0,05). RESULTADOS: Nos segmentos sem trânsito fecal ocorre desenvolvimento de colite que piora com o tempo de exclusão. Segmentos sem trânsito sofrem maiores níveis de estresse oxidativo quando comparados àqueles com trânsito, piorando com o tempo de exclusão. Os níveis de estresse oxidativo encontram-se diretamente relacionados a piora da inflamação. O conteúdo total de ß-catenina no cólon sem trânsito reduz após seis semanas de exclusão. O conteúdo de ß-catenina no ápice das criptas cólicas diminui com o tempo, enquanto na região basal, aumenta. O conteúdo total da β-catenina encontra-se inversamente relacionado ao grau de inflamação e aos níveis de estresse oxidativo. CONCLUSÃO: Existe redução no conteúdo de ß-catenina, principalmente no ápice das glândulas cólicas e aumento nas regiões basais, relacionadas à piora do estresse oxidativo. (AU)

Perda da adesão célula-célula mediada pela E-caderina em câncer colo-retal: vias de sinalização envolvidas

Durante a progressão do câncer colo-retal, alguns eventos são cruciais para iniciar o processo metastático. Estes eventos envolvem a desorganização dos contatos célula-célula, aumento da motilidade e invasividade celular, os quais fazem parte de um programa morfogenético conhecido como transição epitélio-mesenquimal (TEM). A adesão célula-célula é controlada por um sistema de proteínas de membrana, conhecido como complexo juncional apical, o qual é formado pelas junções tight e aderentes. A glicoproteína transmembrana E-caderina é a principal proteína das junções aderentes e desempenha um importante papel na regulação da organização e manutenção da adesão célula-célula, e de sinais intracelulares que medeiam a proliferação e motilidade celular. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares que regulam a desorganização das junções aderentes mediada pela Ecaderina, no câncer colo-retal, ainda não estão definidos. No presente estudo usando uma linhagem celular de câncer de cólon humano, Caco-2, foram avaliadas as vias de sinalização envolvidas na perda de adesão célula-célula mediada pela Ecaderina e aumento do potencial migratório causado por TPA e EGF, assim como o envolvimento da Na+/K+-ATPase na desorganização das junções aderentes induzida pela ouabaína. Nossos resultados mostraram que os tratamentos com 200 nM de TPA e 100 ng/mL de EGF causaram desorganização das junções aderentes, e este evento foi modulado de forma diferencial pelas proteínas ERK1/2 e Src. A proteína ERK1/2 participando da modulação nos períodos iniciais dos tratamentos e a proteína Src atuando em resposta tardia. Além disso, o tratamento com estes agentes induziu um aumento da motilidade celular, sendo este efeito revertido pelo tratamento com o inibidor de Src, o PP1. Por outro lado, o tratamento com 10 e 100 μM de ouabaína também causou alterações morfológicas das junções aderentes e redistribuição da E-caderina. Este efeito parece ser modulado pela proteína ERK1/2, considerando o aumento da atividade desta proteína analisado em paralelo. Adicionalmente, foi observado que a ouabaína causou redução dos níveis protéicos a subunidade 1 da Na+/K+-ATPase e um aparente acúmulo citoplasmático da b-mas não da a-catenina. Em conclusão, nossos resultados indicam que a desorganização da adesão célula-célula mediada pela E-caderina, provocada por TPA e EGF, pode ser modulada inicialmente por ERK1/2 e posteriormente pela Src, sendo esta última também responsável pelo aumento da motilidade celular. E, além disso, os experimentos com ouabaína mostraram um papel importante da subunidade b1 da Na+/K+-ATPase na desorganização das junções aderentes e da proteína ERK1/2 como moduladora deste evento. Nossos resultados podem contribuir para o entendimento dos mecanismos que medeiam a desorganização dos contatos célula-célula mediado pela E-caderina e, de forma geral, da progressão do carcinoma colo-retal.

During tumor development, some events are crucial to trigger the metastatic process. These events involve the disassembly of cell-cell contacts, increase of cell motility and invasivity, which are part of a morphogenetic program called epithelial mesenchymal transition (EMT). The cell-cell adhesion is controlled by a system of membrane proteins, known as the apical junctional complex, which is constituted for tight and adherent junctions. The transmembrane glycoprotein E-cadherin is the main adherens junction protein that plays a critical role in the organization and maintenance of cell-cell adhesion, and regulates intracellular signals to mediate cell proliferation and motility. Nevertheless, the cellular and molecular mechanisms that regulate the disassembly of the E-cadherin-mediated adherens junction in colorectal cancer, remain to be defined. In present study, using a human colon cancer cell line, Caco-2, we evaluate cell signaling pathways involved with the disassembly of Ecadherin- mediated cell-cell adhesion and the migratory potential caused by TPA and EGF. Furthermore, the roles of Na+/K+-ATPase on the adherens junction disassembly caused by ouabain, as well as cellular events involved also were analyzed. Our results show that treatment with 200 nM TPA and 100 ng/mL EGF caused adherens junction disruption in an event differentially modulated by ERK1/2 and Src proteins. ERK1/2 protein modulates adherens junction disassembly in early periods of treatment whereas Src protein in a later response. Besides, treatment with these agents induced an increase of cell motility, a process modulated by Src. On the other hand, treatment with 10 and 100 μM ouabain also caused morphological alterations of adherens junction and E-cadherin redistribution, and these events seem to be modulated by ERK1/2, considering the increased activity of this protein analyzed in parallel. Additionally, we observed reduction of protein levels of the Na+/K+-ATPase b1-subunit and apparent accumulation of b-catenin, but not a-catenin at the cytoplasm, after treatment with ouabain. In conclusion, our results indicate that disassembly of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion, promoted by TPA and EGF may be initially modulated by ERK1/2 and subsequently by Src. This later protein was also responsible by regulate the increase of cell motility induced by these agents. Furthermore, we showed that ouabain induces adherens junction disassembly concomitantly to decreasing protein levels of the Na+/K+-ATPase b1- subunit, and these events may be modulated by ERK1/2. Our findings may contribute for the understanding of mechanisms that mediate disassembly of E-cadherinmediated cell-cell contacts and of a general manner on the progression of colorectal carcinoma.