Desenvolvimento e validação de técnica quantitativa de análise de imagem para avaliação do teste do cometa corado pela prata / Development and validation of a quantitative image analysis method to evaluate comet assay (silver staining)

INTRODUÇÃO: O ensaio do cometa ou técnica da eletroforese de células isoladas é largamente empregado para avaliação de danos e reparo do DNA em células individuais. O material pode ser corado por técnicas de fluorescência ou por sal de prata. Este último apresenta vantagens técnicas, como o tipo de microscópio utilizado e a possibilidade de armazenamento das lâminas. A análise dos cometas pode ser feita de modo visual, porém há a desvantagem da subjetividade dos resultados, que pode ser minimizada por análise digital automatizada. OBJETIVOS: Desenvolvimento e validação de método de análise digital de cometas corados por sal de prata. MÉTODOS: Cinquenta cometas foram fotografados de maneira padronizada e impressos em papel. Além de medidas manualmente, essas imagens foram classificadas em cinco categorias por três avaliadores, antes e depois de pré-processadas automaticamente pelo software ImageJ 1.38x. As estimativas geradas pelos avaliadores foram comparadas quanto sua correlação e reprodutibilidade. Em seguida, foram desenvolvidos algoritmos de análise digital das medidas, com base em filtros estatísticos de mediana e de mínimo. Os valores obtidos foram comparados com os estimados manual e visualmente após o pré-processamento. RESULTADOS: As medidas manuais das imagens pré-processadas apresentaram maior correlação intraclasse do que as imagens preliminares. Os parâmetros automatizados apresentaram alta correlação com as medidas manuais pré-processadas, sugerindo que este sistema aumenta a objetividade da análise, podendo ser utilizado na estimativa dos parâmetros dos cometas. CONCLUSÃO: A presente análise digital proposta para o teste do cometa corado pela prata mostrou-se factível e de melhor reprodutibilidade que a análise visual.

BACKGROUND: Comet assay or single cell gel electrophoresis is a useful and widely applied technique for the assessment of DNA damage and repair in individual cells. Nuclei can be stained with fluorescence methods or silver salts. The latter has technical advantages such as the type of microscope used and the possibility of slide storage. Comet analysis may be performed visually, however, there is the disadvantage of subjective results, which can be minimized by automated digital analysis. OBJECTIVES: Development and validation of digital analysis method for silver stained comet assays. METHODS: Fifty comets were photographed in a standardized way and printed on paper. Before and after being automatically preprocessed by ImageJ 1.38x software, the images were manually measured and classified into five categories by three evaluators. Their estimates were compared as to their correlation and reproducibility. Afterwards, an algorithm for automated digital analysis of the comet measurements was developed based on statistical filters of median and minimum. These results were compared with those manually and visually estimated after preprocessing. RESULTS: Manual measurements of preprocessed images showed higher intraclass correlation than the original ones. Automated results had high correlation with the pre-processed manual measurements, suggesting that this system increases objectivity and can be used in the estimation of comet parameters. CONCLUSIONS: Digital analysis of silver stained comet assay proved to be feasible and better reproducible than the visual analysis.

Biofilme detectado em ponta de cateter venoso central por cultura usando método quantitativo / Biofilm detection on central venous catheter using a quantitative culture method

O cateter venoso central é um instrumento médico muito usado no monitoramento de pacientes em estado crítico. O uso destes cateteres expõe o paciente ao risco de infecções locais e sistêmicas. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de microrganismosque colonizam cateteres venosos centrais usando método quantitativo de cultura. No período de um ano foram analisadas 118 pontas de cateter venoso central e 42 amostras de sangue de veia periférica colhidas de 100 pacientes internados em unidade deterapia intensiva de um hospital (idade média de 57,8±0,3). De um segmento de 2,0cm foi realizada uma cultura quantitativa usando a água Mili-Q que lavou a superfície interna do cateter, após agitação em vortex. De uma diluição 1/10, uma alíquota de 100μl foi semeada em placas de ágar sangue. As colônias foram relatadas como UFC/ml. Este método requer crescimento ≥103 UFC/ml para mostrar que o cateter esta colonizado. Os dados obtidos mostraram que 28,8% pontas estavam colonizadas. Foram isolados 33 cepas microbianasGram-positivas predominando S. aureus (30,7%), S. epidermidis (7,7%) e C. albicans (1,9%). Dezenove Gram-negativas, das quais A. baumannii (9,7%), E. aerogenes (5,8%), P. aeruginosa (3,9%) e S. maltophilia (3,9%) foram isolados. Das 42 culturas de sangue, quatro foram positivas e duas mostraram S. aureus, uma S. maltophilia e uma C. freundii. O perfil de suscetilidade de S. aureus mostrou múltipla resistência antimicrobiana aos aminoglicosídeos, cloranfenicol, lincosamidas, macrolídeos, penicilinas, quinolonas