Sucrose hydrolysis by invertase using a membrane reactor: effect of membrane cut-off on enzyme performance

Sucrose hydrolysis by invertase [EC.3.2.1.26] produces inverted sugar syrup, an ingredient mainly used in the food industry. To properly catalyze hydrolysis, the enzyme should be reused after this reaction. It is advisable to maintain constant activity over a considerable period. Thus, sucrose hydrolysis was performed in a membrane bioreactor - a continuously stirred tank reactor coupled with an ultrafiltration membrane (UFM) which provides good diffusion and high activity per unit volume. Molecular weight cut-off for soluble invertase UFMs was up to 100kDa. This study focused on the role of UFM invertase cut-off as it is the main element in the process. We demonstrated that both the cut-off and chemical nature of the UFM affected specific invertase activity.

A hidrólise da sacarose através da invertase [EC.3.2.1.26] gera xarope de açúcar invertido, que é usado principalmente como ingrediente na indústria alimentícia. Para ter-se uma hidrólise satisfatória, a enzima deve ser reaproveitada após a reação. É desejável que sua atividade seja mantida constante durante um período considerável de reação. A hidrólise da sacarose foi realizada em um reator com membrana (RM) - que é um reator continuamente agitado acoplado a uma membrana de ultrafiltração (MUF) -, porque apresenta efeitos mínimos de difusão e elevada atividade por unidade de volume. O corte molecular da MUF utilizada para reter a invertase solúvel dentro do MR foi de até 100kDa. Como a invertase é o elemento principal deste processo, este trabalho foi focado no papel do corte molecular da MUF na sua atividade. O corte molecular e a natureza química da membrana-UF mostraram afetar a atividade específica da invertase.

Inverted sugar syrup attained from sucrose hydrolysis using a membrane reactor / Xarope de açúcar invertido obtido a partir de hidrólise da sacarose utilizando um reator com membrana

Invertase, whether adsorbed on styrene-divinylbenzene copolymers or otherwise, was used for continuous sucrose hydrolysis using a cell-type membrane reactor (CTMR), coupled with an ultra (UF-100kDa), or a microfiltration (MF- pore diameter of 5 µm) membrane. In all tests, the pH (5.5), temperature (30 ºC), reaction volume (10 mL) and agitation (100 rpm) were set constant; whereas, variable parameters were: feeding rate (0.4, 0.8 and 1.6 h-1), inlet sucrose concentration (2.5, 6.5, 50 and 100 mM) and enzyme/resin ratio (1.64 mg or 3.28 mg of protein per 25, 50 or 100 mg of resin). The best result (yield of 100 percent, steady-state duration over 20h and specific reaction rate over 243 x 10-3 mmol/h.mE) was obtained when insoluble invertase (1.64 mg protein/100 mg resin) was used to convert 50 mM or 100 mM of sucrose solution at 0.4 h-1 using a UF-CTMR.

Invertase, na forma adsorvida ou não em copolímeros de estireno-divinilbenzeno, foi usada para a hidrólise contínua de sacarose utilizando um reator com membrana (RM), acoplado a uma membrana de ultrafiltração (UF-100kDa), ou de microfiltração (MF - um diâmetro de poro de 5µm). Em todos os testes, o pH (5,5), a temperatura (30ºC), o volume reacional (10mL) e a agitação (100 rpm) foram mantidas constantes; os parâmetros variados foram: a vazão de alimentação (0,4; 0,8 e 1,6 h-1), a concentração de sacarose alimentada (2,5; 6,5; 50 e 100 mM) e a relação enzima/resina (1,64 mg ou 3,28 mg de proteína por 25, 50 ou 100 mg de resina). O melhor resultado (um rendimento de 100 por cento, um período de estado estacionário acima de 20h e uma taxa de reação específica maior de 243 x 10-3 mmol/h.mE) foi obtido quando a invertase insolúvel (1,64 mg de proteína/100 de mg resina) foi usado para converter 50 mM ou 100 mM de solução de sacarose a 0,4 h-1 usando UF-RM.

Emprego de reator com membrana na obtenção da frutose e ácido glicônicoa partir da sacarose / Fructose and gluconic acid production by sucrose convesion in a membrane bioreactor

Frutose e Ácido Glicônico são produtos importados empregados em diferentes setores nas áreas química, farmacêutica e alimentícia, representando um mercado de dois milhões de dólares (US$ 2,0 milhões) por ano. Por sua vez, a sacarose pode ser empregada como matéria-prima para a obtenção destes produtos através de conversão enzimátiva empregando invertase e glicose-oxidase. O uso de biorreatores com membrana (MBR) mostra-se interessante em processos enzimáticos, pois, ao serem empregados em processos contínuos permitem, simultaneamente, produção e separação dos produtos, reduzindo a formação de subprodutos e, eventual, inibição da enzima por excesso de substrato ou produtos. A sacarose é convertida em xarope de açúcar invertido (solução equimolar de frutose e glicose) pela invertase (Bioinvert`marca registrada’, enzima comercial), seguido pela oxidação da glicose em ácido glicônico pela ação da glicose oxidase (GO). O processo de conversão multi-enzimático da sacarose foi obtido através da alimentação de sacarose (50 mM) em reator com membrana (MBR) contendo invertase (24 U/mL), glicose-oxidase (0,5 U/mL) e catalase (470 U/mL) e operando com vazão específica de 6,0 ‘h POT. -1’, 35`graus’C e pH 5,5. As condições operacionais otimizadas possibilitaram a conversão completa da sacarose (X = 100 %) e da glicose resultante (Y = 100%) com velocidades específicas de reação de 4,2 mmol/U.h, 0,60 mmol/U.h e 0,00062 mmol/U.h, respectivamente, para a invertase, glicose oxidase e catalase. A respeito da oxidação da glicose, a adição de catalase no meio reacional se fez necessária para minimizar os efeitos inibitórios sobre a GO através do peróxido de hidrogênio formado

The fructose and gluconic acid are products of great application in chemical, pharmaceutical and food industry. The actual Brazilian market for these compounds is about US$ 2 millions, here as the sucrose, the raw-material used for their production, represents about 2.4% of the Brazil's GNP. This conversion increases the value added to the sugarcane, usually marketed as a commodity, because the fructose and gluconic acid are more valuable products than sucrose. The use of membrane bioreactor (MBR), which operates under mild conditions regarding internal pressure, temperature and pH, has been growing along the years for enzyme catalyzed processes. Moreover, in the MBR the reaction and separation of the products occur simultaneously, avoiding the formation of by-products and the eventual inhibition of the enzyme caused by excess of substrate or products. The sucrose is converted to the inverted syrup (an equimolar solution of fructose and glucose) by invertase (in this work was employed Bioinvert®, a commercial invertase) followed by the oxidation of glucose in gluconic acid by the glucose oxidase (GO). The multi-enzymatic conversion of sucrose was attained when carried out under initial substrate of 50mM and invertase, glucose oxidase and catalase concentrations, respectively, of 24.0 U/mL, 0.5 U/mL and 470 U/mL in a membrane reactor utilizing a dilution rate of 6.0 h-1, 35ºC and pH 5.5. The optimized operational conditions led to a conversion yield of 100% for sucrose hydrolysis and glucose oxidation steps resulting in enzyme productivity of 4.2 mmol/U.h, 0.60 mmol/U.h and 0.00062 mmol/U.h, respectively, to invertase, glucose oxidase and catalase. In regard to the glucose oxidation, the addition of catalase in the reaction medium was necessary, in order to minimize the inhibition of the GO by the hydrogen peroxide formed.