Analytical methods for assessing changes induced by gamma exposure in an animal model

SUMMARY OBJECTIVE: Ionizing radiation can cause radio-induced changes in the cellular metabolome due to the breakdown of DNA bonds. Our goal was to find the early tissue response to radiation exposure supported by distinct analytical methods. METHODS: Histological analyses were performed on the organs extracted from rats to search for microscopic changes. The histological slides stained with hematoxyline-eosin (HE) were analyzed in magnification (40x). Subsequently, the tissues were subjected to mass spectrometry that allowed molecular analysis and DESI-MSI that generated the molecular image of lipids, assessing changes in intensities, especially in the brain. RESULTS: The histological analysis found nonspecific inflammatory changes; no areas of fibrosis, necrosis, or apoptosis were identified, suggesting non-morphological tissue alterations. However, the DESI-MSI images of brain lipids allowed the observation of many radio-induced changes in the lipid's intensities. CONCLUSIONS: No early radio induced histological or mass weight changes in the radiation exposed rats could be observed at 5 Gy. However, early changes in the molecular level were observed in the DESI-MSI images of the brain lipids. The DESI-MSI method proved to be efficient and relevant, allowing a regional molecular analysis of the tissues, expanding a new field of study that is still in its infancy: radiometabolomics.

RESUMO OBJETIVO: Radiação ionizante pode causar alterações no metaboloma celular devido à quebra de ligações no DNA. O objetivo deste trabalho foi evidenciar a resposta aguda tecidual induzida pela exposição da radiação ionizante. MÉTODOS: Análises histológicas foram realizadas nos órgãos extraídos de ratos para análise de alterações microscópicas. As lâminas histológicas coradas com hematoxilina eosina (HE) foram analisadas em aumento (40x). Posteriormente, os tecidos foram submetidos a espectrometria de massa, que permitiu análise molecular e o Desi-MSI que gerou imagem molecular de lipídios, identificando alterações na intensidade, principalmente no cérebro. RESULTADOS: As análises histológicas encontraram alterações inflamatórias inespecíficas, nem áreas de fibrose, necrose ou apoptose, sugerindo ausência de alterações morfológicas. As imagens de lipídios cerebrais obtidas por Desi-MSI permitiram observar as inúmeras alterações na intensidade nas seções teciduais do encéfalo. CONCLUSÕES: Alterações agudas radioinduzidas de massa do órgão e histológicas nos órgãos dos ratos expostos não puderam ser observadas a 5 Gy. Entretanto, mudanças em nível molecular foram observadas nas imagens de Desi-MSI dos lipídios cerebrais. O método Desi-MSI mostrou-se eficiente e relevante, permitindo a análise molecular regi-onal dos tecidos no SNC, expandindo um novo campo de estudo que ainda está em sua infância: a radiometaboloma.

Expressão e atividade de sistemas de dois componentes (TCS) de Salmonella enterica sorovar Typhimurium no contexto do metaboloma intestinal humano / Expression and activity of two-component systems of Salmonella enterica sorovar Typhimurium in the context of the human intestinal metabolome

A interação entre membros do microbioma intestinal humano, células hospedeiras e patógenos invasores pode ocorrer de diversas formas, sendo uma delas através de pequenas moléculas chamadas metabólitos. A percepção e resposta efetiva de um microrganismo às diferentes condições encontradas em seu ambiente, incluindo metabólitos produzidos por outros microrganismos, são fatores importantes para sua adaptação, sobrevivência e disseminação. Os sistemas de dois componentes (TCS) permitem a percepção e resposta a mudanças ambientais, regulando a expressão de genes específicos. Nosso grupo mostrou anteriormente que um extrato orgânico de fezes humanas (EF), bem como o ácido 3,4-dimetilbenzoico (3,4-DMB), encontrado no EF, inibe a capacidade de Salmonella enterica sorovar Typhimurium de invadir células hospedeiras. O presente trabalho propôs investigar o impacto do microbioma intestinal humano, bem como de pequenas moléculas produzidas por Clostridium citroniae (membro deste microbioma) na expressão e atividade dos genes de TCS de Salmonella. Os metabólitos de EF e de culturas puras de C. citroniae foram extraídos com acetato de etila e adicionados a meio de cultura. O pH do meio foi ajustado (~ 7,4) e a solução foi esterilizada por filtragem. Salmonella foi cultivada na presença ou ausência do EF e do extrato de C. citroniae, bem como do ácido 3,4-DMB, em condições aeróbias e anaeróbias, até alcançar o meio da fase logarítmica de crescimento. O RNA foi extraído para a realização de PCR em Tempo Real utilizando iniciadores direcionados a quase todos os TCS de Salmonella. Nossos resultados mostraram que vários genes de TCS envolvidos na virulência de Salmonella (SsrAB, EnvZ-OmpR, QseCB, PhoQP, TorSR, TtrRS) foram regulados diferencialmente por esses metabólitos, tanto em condições aeróbias quanto anaeróbias. EnvZ-OmpR, PhoPQ e SsrAB estão diretamente envolvidos na regulação das Ilhas de Patogenicidade 1 e 2 de Salmonella. QseCB é crucial para a detecção de quorum em Salmonella, de hormônios hospedeiros e para a regulação da motilidade (swimming). Vários outros TCS também foram regulados, incluindo TorSR e TtrRS, envolvidos na regulação da respiração anaeróbica de N-óxido de trimetilamina (TMAO) e tetrationato, respectivamente. Esses compostos são importantes para a sobrevivência de Salmonella no ambiente anaeróbico do intestino humano. Nossos resultados de avaliação de expressão gênica global de Salmonella cultivada na presença de ácido 3,4-DMB (aerobiose e anaerobiose) bem como na presença do EF em anaerobiose, mostraram que genes condificados em SPI-1 e SPI-2, SPI-4 e alguns genes do TCS foram reprimidos, enquanto genes marR, marB e marA foram ativadas nessas condições. Adicionalmente, comparamos nossos resultados de RNAseq, de Salmonella cultivada na presença do ácido 3,4-DMB em aerobiose, com resultados disponíveis da base de dados Salmonella Compendium. Ainda, a capacidade de Salmonella de adentrar e sobreviver dentro de células fagocíticas (macrófagos RAW 264.7) parece ser afetada pelas três condições testadas neste trabalho. Nossos resultados mostram que importantes vias de sinalização da virulência de Salmonella podem ser moduladas pelos metabólitos presentes no microbioma intestinal humano e abrem caminhos para novas pesquisas sobre a sinalização intercelular microbioma-patógeno no ambiente intestinal.

The interaction between members of the human gut microbiome, host cells and invading pathogens often occurs through small molecules, also called metabolites. The perception and effective response of a microorganism to the different conditions found in its environment, including metabolites produced by other microbes, is important for its adaptation, survival and dissemination. Two-component systems (TCS) allow the perception and response to environmental changes by regulating the expression of specific genes. Our group previously showed that organic extracts of human feces (EF) as well as the specific metabolite 3,4-dimethylbenzoic acid (3,4-DMB) found within the EF, inhibit the ability of Salmonella enterica sorovar Typhimurium to invade host cells. In the present work, we investigated the impact of the human gut microbiome as well as small molecules produced by Clostridium citroniae (a member of this microbiome) on the expression and activity of Salmonella TCS genes. Metabolites (from feces or C. citroniae cultures) were extracted using ethyl acetate and added to culture medium. The pH of the medium was adjusted (~7.4), and the solution was filter sterilized. Salmonella was grown in the presence or absence of the organic extracts as well as 3,4-DMB acid under aerobic and anaerobic conditions until it reached mid-log growth. RNA was then extracted for Real-time PCR using primers targeting almost all Salmonella TCS. Our results showed that several TCS involved in Salmonella virulence (SsrAB, EnvZ-OmpR, QseCB, PhoQP, TorSR, TtrRS) were differentially regulated by these metabolites both in aerobic and anaerobic conditions. EnvZ-OmpR, PhoPQ, and SsrAB are directly involved in the regulation of Salmonella Pathogenicity Islands 1 and 2. QseCB is crucial for Salmonella =quorum sensing, sensing of host hormones and regulation of swimming motility. Several other TCS were also regulated, including TorSR and TtrRS, which are involved in the anaerobic respiration of trimethylamine N-oxide (TMAO) and tetrathionate, respectively. These compounds are important for Salmonella survival in the anaerobic environment of the human gut. Our results of the evaluation of global Salmonella gene expression grown in the presence of 3,4-DMB acid (aerobiosis and anaerobiosis) as well as in the presence of EF in anaerobiosis, showed that genes encoded in SPI-1 and SPI-2, SPI-4 and some TCS genes have been repressed, while multiple drug resistance genes, as well marR, marB and marA genes have been activated under these conditions. Besides, we compared our results of RNAseq, Salmonella was grown in the presence of 3,4-DMB acid in aerobiosis, with results available from the Salmonella Compendium database. Also, Salmonella's ability to enter and survive within phagocytic cells (macrophages RAW 264.7) appears to be affected by the three conditions tested in this work. Our results show that important Salmonella virulence signalling pathways can be modulated by the metabolites present in the human intestinal microbiome and open the way for further research on the microbiome-pathogen intercellular signalling in the intestinal environment.

Eating behavior of schizophrenic patients / Comportamento alimentar de pacientes com esquizofrenia

ABSTRACT Objective To assess the eating behavior, food practices, nutritional and metabolic profiles of patients with schizophrenia undergoing treatment. Methods Cross-sectional exploratory descriptive qualitative study used a semi-structured questionnaire on the eating behavior, food practices, and perception of changes after the initiation of drug therapy and a quantitative method using anthropometric and body composition measurements, metabolic parameters, and 5-day dietary records to analyze nutrient ingestion of patients with schizophrenia in an outpatient clinic at a tertiary hospital (n=33). The qualitative data were analyzed and coded by three researchers and quantitative data were analyzed using descriptive exploratory statistics. Results The results of this study showed that schizophrenic patients presented high prevalence of excess weight (71.0%), metabolic syndrome (42.0%), dyslipidemia (62.0%), changes in appetite (76.0%), and increase in energy intake (74.2%), associated with important irregularities in eating behavior and food practices (such as irregularity of meals, emotional intake, high carbohydrate and fat intake, and low energy expenditure) and lifestyle (changes in social and work routines). Conclusion This eating profile may interact synergistically with psychotropic drugs to contribute to weight gain and metabolic changes in schizophrenia. Nutrition education may prevent and monitor the risk of metabolic and nutrition problems, irrespective of the medications used.

RESUMO Objetivo Avaliar o comportamento e as práticas alimentares, o perfil nutricional e metabólico de pacientes com esquizofrenia em tratamento ambulatorial de um hospital terciário. Métodos Trata-se de estudo descritivo exploratório transversal com abordagem qualitativa utilizando questionário semi-estruturado sobre comportamentos alimentares, práticas alimentares e percepção de mudanças após o início da terapia medicamentosa e abordagem quantitativa usando medidas antropométricas e de composição corporal, parâmetros metabólicos e registros alimentares por cinco dias para analisar a ingestão de nutrientes em pacientes com esquizofrenia (n=33). Os dados qualitativos foram analisados e codificados por três pesquisadores e os dados quantitativos foram analisados utilizando estatísticas exploratórias descritivas. Resultados Os resultados deste estudo mostraram que os pacientes com esquizofrenia apresentaram uma alta prevalência de excesso de peso (71,0%), síndrome metabólica (42,0%) e dislipidemia (62,0%), com alterações no apetite (76,0%), consumo excessivo de energia (74,2%), associado à irregularidades no comportamento alimentar e nas práticas alimentares (como a irregularidade das refeições, o consumo emocional, a ingestão elevada de carboidratos e gorduras e o baixo gasto de energia) e o estilo de vida (mudanças nas rotinas sociais e de trabalho). Conclusão Esse perfil alimentar pode interagir sinergicamente com às drogas psicotrópicas utilizadas o tratamento de esquizofrenia contribuindo com o ganho de peso e alterações metabólicas após o diagnóstico da doença. Nesse sentido, acredita-se que a educação nutricional pode prevenir e monitorar o risco de problema metabólico e nutricional, independentemente dos medicamentos utilizados.

Distinctive profile of the 17-hydroxylase and 17,20-lyase activities revealed by urinary steroid metabolomes of patients with CYP17 deficiency / Perfil característico das atividades 17-hidroxilase e 17,20-liase reveladas por meio do metaboloma de esteroides urinários de pacientes com deficiência de CYP17

OBJECTIVES: (1) Characterize serum (S) and urinary (U) steroid metabolites in complete CYP17 deficiency (cCYP17D); (2) analyze the relative 17α-hydroxylase (17OH) and 17,20-lyase (17,20L) activities in vivo; and (3) comparedata from the two most prevalent mutations in Brazil. SUBJECTS AND METHODS: 20 genotyped cCYP17D patients from a previously reported cohort were homozygous for W406R or R362C; 11 controls were CYP17 wild types (WT). WT and cCYP17D patients had S and U samples drawn to measure: cortisol (F), corticosterone (B), deoxycorticosterone (DOC), 18OH-B, 18OH-DOC, and 17OHP; and tetrahydro (TH)-B, THA, THDOC, THF+5α-THF, TH-cortisone, androsterone, etiocholanolone, 5-pregnenediol, 17OH-pregnenolone and pregnanetriol. RESULTS: Compared to WT, cCYP17D patients had marked elevations of B, DOC, 18OH-B and 18OH-DOC, whereas 17OHP, F and adrenal androgens (AA) were reduced; U steroids parallel S findings. Metabolite ratios revealed that both 17OH and 17,20L activities were impaired in cCYP17D. There were nodifferences between W406R andR362C mutations. CONCLUSIONS: cCYP17D patients show parallel overproduction/overexcretion of 17-deoxysteroids, and marked reduction of F and AA. In addition to 17OH, 17,20-L activity was also impaired in cCYP17D. W406 and R362C mutations disclose similar Sand U patterns.

OBJETIVOS: (1) Caracterizar os esteroides séricos (S) e urinários (U) na deficiência completa da CYP17 (DcCYP17); (2) analisar as atividades da 17α-hidroxilase (17OH) e 17,20-liase (17, 20 L) in vivo; e (3) comparar as duas mutações mais prevalentes no Brasil. SUJEITOS E MÉTODOS: 20 pacientes genotipados para a DcCYP17, de uma coorte anterior, eram homozigotos para W406R ou R362C (8 cada); 11 controles eram CYP17 wild types (WT). Amostras de S e U foram colhidas dos WT e pacientes para dosagem de: cortisol (F), corticosterona (B), deoxicorticosterona (DOC), 18-OH-B, 18OH-DOC e 17OHP; e tetraidro(TH)-B, THA, TH-DOC, THF+5α-THF, THE, androsterona, etiocolanolona, 5-pregnenediol, 17OH-pregnenolona e pregnanetriol. RESULTADOS: Comparados aos WT, os pacientes com DcCYP17 revelaram elevações acentuadas de B, DOC, 18OHB e 18OHDOC, enquanto 17OHP, F e andrógenos adrenais (AA) estavam reduzidos. Os esteroides na U acompanham os achados no S. As relações de metabólitos mostraram que as atividades de 17OH e 17,20L estavam reduzidas em pacientes com DcCYP17. Não houve diferenças entre pacientes com as mutações W406R e R362C. CONCLUSÕES: Na DcCYP17, a produção e a excreção dos 17-deoxiesteroides estão aumentadas em paralelo, em contraste com a reduzida produção/excreção de F e AA. As atividades da 17OH e 17,20-L estão diminuídas na DcCYP17. As mutações W406 e R362C apresentam achados semelhantes em S e U.