RESUMO
Rhinoclemmys nasuta (Testudines: Geoemydidae) es considerada una especie casi endémica de Colombia y la más primitiva del género, sin embargo, se encuentra clasificada por la IUCN como deficiente de datos, ya que la información disponible no es suficiente para hacer una evaluación directa o indirecta de su riesgo de extinción. En este trabajo se describe la implementación del método para realizar la secuenciación de la región control del ADN mitocondrial de R. nasuta, con el propósito de generar herramientas técnicas para futuros estudios de evolutivos y de conservación. Se utilizó el método de desalamiento (Salting-out) para extraer ADN a muestras sanguíneas procedentes de Isla Palma y Playa Chucheros (Bahía Málaga-Pacífico Colombiano) y se utilizó una pareja de cebadores degenerados (reportada para Chrysemys picta Testudines: Emydidae) para realizar la amplificación. Se obtuvieron fragmentos de 800pb siendo exitosa la reacción de secuenciación de los amplificados, y se estableció un porcentaje de homología mayor al 92 % entre las secuencias obtenidas y las secuencias de ADNmt de Sacalia quadriocellata (Testudines:Geoemydidae) y Cuora aurocapitata (Testudines:Geoemydidae), depositadas en el GeneBank. Este resultado demuestra que el método descrito puede ser una herramienta útil para el estudio de las poblaciones de R. nasuta del Pacífico colombiano, lográndose una efectiva secuenciación de la región control del ADNmt de esta especie.
Rhinoclemmys nasuta (Testudines:Geoemydidae) is considered an almost endemic specie to Colombia and the most primitive species of Rhynoclemmys. However, it is classified data deficient by IUCN because the available information is not enough to make a direct or indirect assessment of its extinction risk. Here, we describe the implementation of the method to analyze the mitochondrial DNA control sequence (mtDNA) of R. nasuta in order to generate tools for future studies in systematics and population conservation. Genomic mtDNA was extracted by salting-out from blood samples from Isla Palma and Playa Chucheros (Bahía Málaga-Colombian Pacific Coast) and we used a pair of degenerate primers (reported for Chrysemys picta, Testudines:Emydidae) to perform amplification. Fragments of 800pb were obtained and the sequencing reaction was effective. A homology percentage above of 92 % was established between the obtained sequences and mtDNA sequences from Sacalia quadriocellata (Testudines:Geoemydidae) ,and Cuora aurocapitata (Testudines:Geoemydidae) reported in the GenBank. This result shows that the described method can be a useful tool for the study of R. nasuta populations in the Colombian Pacific region, achieving an effective sequencing of the mtDNA control region of this species.
RESUMO
Se realizó la caracterización de la diversidad genética de la población de Rhinoclemmys nasuta, que habita en la localidad insular de Isla Palma, Bahía Málaga (Valle del Cauca), utilizando tres sistemas de microsatélites (Cm72, Cm58 y Cm3). En esta localidad, R. nasuta se encuentra ampliamente distribuida en los sistemas de riachuelos y quebradas presentes. Se tomaron entre 100 a 200 µL de sangre periférica de diez tortugas en cinco riachuelos, preservando las muestras en una solución 0,5 M de EDTA y el ADN fue extraído mediante las técnicas de Salting-out y Chelex. Los productos amplificados por PCR fueron visualizados y medidos en geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata. Se obtuvieron productos amplificados exitosos para todos los sistemas analizados, dos de los cuales (Cm72 y Cm3) resultaron ser monomórficos, mientras que el sistema Cm58 presentó un PIC alto (0,698) permitiendo estimar la diversidad genética de esta población. La heterocigosidad observada fue baja (Ho = 0,26) y los índices de endogamia F IS y F IT fueron altos (0,67857 y 0,67881), indicando un exceso de homocigotos en cada uno de los ríos y para la población total. El Análisis Molecular de Varianza sugirió que no existe estructura genética diferencial en esta población (F ST = 0,00075; p = 0,95112). En conclusión los resultados sugieren que la diversidad genética de la población de R. nasuta en Isla Palma es baja, siendo una población altamente endogámica.
Characterization of the genetic diversity of Rhinoclemmys nasuta population inhabits Isla Palma (Malaga Bay, Valle del Cauca) was carried out using three microsatellite systems (Cm72 , Cm58 and Cm3). In this locality, individuals of R. nasuta are widely distributed in the inland streams and creeks system. 100 to 200 mL of peripheral blood was taken off from ten turtles in five streams of the island, preserving samples in a 0.5 M EDTA. DNA was extracted using Salting-out and Chelex solution techniques. PCR amplified products were visualized and measured in polyacrylamide gels stained with silver nitrate. Successful amplification products were obtained for all systems analyzed, two of which (Cm72 and Cm3) were found to be monomorphic, while the system Cm58 had a high PIC (0.698) allowing to estimate the genetic diversity of this population. The observed heterozygosity was low (Ho = 0.26) and inbreeding indices FIS and FIT were high (0.67857 and 0.67881), indicating an excess of homozygotes in each of the rivers and for the all population. The molecular analysis of variance suggested that there is no difference in genetic structure of the population (FST = 0.00075, p= 0.95112). Therefore, the results suggest that the genetic diversity of R. nasuta population in Isla Palma was low and exhibited a highly inbred index.