RESUMO
Background: Granulomatous lesions occur in tuberculosis (TB), other infections, toxic, allergic, and autoimmune diseases among others. In absence of a an acid-fast bacilli (AFB) confirmation of TB is necessary. Objective: To assess the efficacy of PCR for TB detection and to correlate with granuloma histology and AFB staining. Methods: We analyzed 380 fixed paraffin-embedded tissues (PETs) of granulomas with and without caseous necrosis; suppurative; sarcoidal; or of chronic nonspecific nature. Nested PCR-IS6110 for Mycobacterium tuberculosis complex (MTB) and a nested pan-Mycobacterium for the hsp65 gene were used for Mycobacterium spp detection. Results: PCR was more sensitive than AFB staining for all five catageories of granulomas: G1: PCR 71%, AFB staining 28%. G2: PCR 37%, AFB 8%. G3: PCR 17%, AFB staining 7%. G4: PCR 8%, AFB staining 4%. G5: PCR 6%, AFB staining 0%. Conclusions: Molecular diagnosis of TB using PCR-based testing is a fast, efficacious and sensitive method that increased the accuracy of PET histological diagnosis associated with granulomatous lesions.
Introducción: Lesiones granulomatosas ocurren en tuberculosis (TBC), otras infecciones, condiciones tóxicas, alérgicas y autoinmunes, entre otras. Con baciloscopia negativa, es necesario confirmar el diagnóstico de TBC. Objetivo: Evaluar la eficacia de la RPC para detectar TBC comparado con baciloscopia en relación a la histología del granuloma. Métodos: Analisis de 380 tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina (TFFP) con diferentes tipos de granulomas: con necrosis caseosa; sin necrosis caseosa; supurativo; sarcoidal; a cuerpo extraño/inespecífico. Utilizamos RPC anidada-IS6110 para detección del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTB) y una pan-RPC anidada-hsp65 para Mycobacterium spp. Resultados: La detección de TBC mediante RPC fue significativamente superior a baciloscopia en los cinco tipos de granuloma: G1: RPC 71%, baciloscopia 28%; G2: RPC 37%, baciloscopia 8%; G3: RPC 17%, baciloscopia 7%; G4: RPC 8%, baciloscopia 4%; G5: RPC 6%, baciloscopia 0%. Conclusión: El diagnóstico de TBC por RPC es un método rápido, eficaz y de gran sensibilidad, que aumenta la precisión del diagnóstico diferencial de lesiones granulomatosas de TFFP procesados rutinariamente en histopatología.
Assuntos
Adolescente , Adulto , Criança , Pré-Escolar , Feminino , Humanos , Lactente , Masculino , Adulto Jovem , DNA Bacteriano/genética , Granuloma/microbiologia , Mycobacterium tuberculosis/genética , Tuberculose/diagnóstico , Diagnóstico Diferencial , Formaldeído , Granuloma/diagnóstico , Inclusão em Parafina , Reação em Cadeia da Polimerase , Valor Preditivo dos Testes , Sensibilidade e Especificidade , Coloração e Rotulagem , Fixação de TecidosRESUMO
Introducción: Helicobacter pylori es considerado uno de los principales agentes causales de gastritis crónica, úlcera péptica y neoplasias gástricas malignas en humanos. Objetivo: evaluar el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para la identificación de H. pylori y sus genotipos en tejidos gástricos con neoplasias malignas embebidos en parafina. Material y Métodos: se estudiaron secciones de 5 bloques de parafina procedentes de 5 pacientes mexicanos con neoplasias gástricas malignas. Se realizaron coloraciones de rutina y especiales de anatomía patológica, así como la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa para la detección del microorganismo y sus genotipos. Resultados: la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa identificó a este agente infeccioso en todos los bloques analizados en correspondencia con su detección a través de las técnicas histológicas. Esta metodología permitió demostrar una variabilidad genética del patógeno en las muestras analizadas según los genotipos vacA y cagA. Conclusiones: la reacción en cadena de la polimerasa podría ser un método eficaz en la identificación del H. pylori en tejidos gástricos con neoplasias malignas embebidos en parafina. Esta se perfila como una estrategia atractiva para realizar estudios de epidemiología molecular y permitirá establecer posibles asociaciones de genotipos/subtipos del microorganismo con variables clínicas, epidemiológicas y de manejo del paciente.
Introduction: Helicobacter pylori is considered one of the main causal agents of chronic gastritis, peptic ulcer and gastric malignant neoplasms in humans. Objective: to evaluate polymerase chain reaction for identification of Helicobacter pylori and its genotypes in paraffin embedded gastric tissues with malignant neoplasms. Material and Methods: sections of five paraffin blocks from five patients with gastric malignant neoplasms were studied. They were analyzed through routine and special stains of pathological anatomy, as well as the polymerase chain reaction technic for microorganism and genotypes detection. Results: the infectious agent was identified in all of the analyzed blocks through the polymerase chain reaction technic in correspondence with its detection through histologic techniques. This methodology showed a genetic variability of the pathogen in the analyzed samples in respect to vacA and cagA genotypes. Conclusions: the polymerase chain reaction could be an efficacious method for the identification of H. pylori in paraffin embedded gastric tissues with malignant neoplasms. It is projected as an attractive strategy for performing studies of molecular epidemiology and the establishment of possible associations between genotypes/subtypes of the microorganism and clinic or epidemiologic variables, and patient handling.
RESUMO
INTRODUÇÃO: A tuberculose cutaneoganglionar (TbCG) corresponde a 25,4 por cento dos casos de tuberculose (Tb) extrapulmonar no estado do Amazonas. Os métodos tradicionais, bacteriológicos e histopatológicos envolvem algumas dificuldades diagnósticas, e a reação em cadeia da polimerase (PCR) surge como método alternativo, podendo propiciar resultados específicos e em menor tempo. Nesse sentido, verificou-se a acurácia do protocolo PCR4 de Marchetti et al. no diagnóstico da TbCG comparativamente aos métodos bacteriológicos e histopatológicos. MATERIAIS E MÉTODOS: Realizou-se o nested-PCR com oligonucleotídeos para a IS6110 do complexo do M. tuberculosis em 83 amostras parafinizadas, sendo 52 cutâneas e 31 ganglionares, de pacientes clinicamente suspeitos de TbCG. Todos os casos foram avaliados pelos métodos bacteriológicos e histopatológicos. Foi realizada análise da acurácia entre os resultados obtidos na PCR em relação ao cultivo e à histopatologia. RESULTADOS E DISCUSSÃO: A positividade da PCR em todos os casos estudados foi de 50,6 por cento (42/83), sendo de 59,6 por cento (31/52) em amostras cutâneas e de 35,5 por cento (11/31) nas ganglionares. Em ambos os grupos foram observados resultados falso-positivos e falso-negativos. Algumas hipóteses que podem justificar estes resultados estão relacionadas à presença da IS6110 em micobactérias ambientais da região amazônica e à não-padronização da amostra de DNA amplificado. CONCLUSÃO: O protocolo em avaliação apresentou positividade em percentual semelhante a diferentes protocolos existentes na literatura. Sugere-se o uso da PCR em tecidos parafinizados associada com o cultivo ou com a histopatologia para o diagnóstico definitivo de Tb ganglionar. Para as lesões cutâneas continua sendo necessária a busca de protocolo que amplie a acurácia do método.
BACKGROUND: Cutaneous lymph node tuberculosis (CLTb) represents 25.4 percent of all cases of extra-pulmonary Tb in the state of Amazonas. The current methods of diagnose including bacteriological and histopathological assays involve some technical difficulties, and the polymerase chain reaction - PCR arise as an alternative method allowing specific results faster than the others. In this context the accuracy of PCR4 Marchetti et al. protocol was compared with traditional methods. MATERIAL AND METHOD: Nested-PCR for IS6110 (123 pb) were applied on 83 CLTb suspicious formalin fixed and paraffin embedded samples of tissues (52 cutaneous and 31 lymph node), obtained from 1997 to 2002. All cases were evaluated by bacteriological and histopathological methods. Accuracy analyses were carried out between the PCR amplification results and those related on bacteriological and histopathological methods. RESULTS AND DISCUSSIONS: Positive results of PCR4 were about 50.6 percent (59.6 percent in cutaneous samples and of 35.5 percent in lymph nodes samples). In both groups were observed false-negative and false-positive results. Some hypotheses that explain those results are related to the presence of IS6110 in environmental mycobacterias in the Amazon region and the absence of standardized DNA concentration to amplification assays. CONCLUSIONS: The proposed protocol was as positive as others ones available in the literature. Definitive Tb diagnostic can be obtained on lymph node paraffin embedded PCR in association with bacteriological or histopathological method. A better accuracy of an amplification assay applied to cutaneous Tb suspicious lesions has to be still under research.
Assuntos
Humanos , Mycobacterium tuberculosis/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da Polimerase/métodos , Tuberculose Cutânea/diagnóstico , Tuberculose dos Linfonodos/diagnóstico , Inclusão em Parafina/métodosRESUMO
BACKGROUND: The most common human archival specimens are formalin-fixed, paraffin-embedded tissues (PETs). DNA can be extracted from PETs, but sometimes, it is unsuitable for molecular techniques as slow degradation of DNA occurs with time. OBJECTIVE: The aim of this study was to verify and discuss if samples of oral PETs archived for the past 40-years are possible substrates for molecular biology studies, using PCR. Methods: The samples were submitted to phenol-chloroform extraction method. DNA was qualified and quantified by spectrophotometer analysis, electrophoresis and amplification by PCR. RESULTS: It was observed a weak positive correlation between genomic DNA yield and specimen age. The agarose gel electrophoresis demonstrated that genomic DNA length was more frequently composed of small fragments. The 268-bp fragments of the beta-globin gene was amplified in 55 percent of cases and preferentially in more recent ones, which showed strong amplification if compared with older samples. WAF1 gene with 149-bp presented weak but detectable amplification in 75 percent of cases. The 536-bp fragment of beta-globin gene was detected in 25 percent of samples. The amplification was intense in genomic DNA extracted from recent cases and weak in older ones. CONCLUSION: This study shown that, despite degradation, it is possible to use genomic DNA obtained from PETs, archived for the past forty years, in PCR amplification of small DNA products, being large DNA fragments more difficult to amplificate.
INTRODUÇÃO: O material fixado em formol e embebido em parafina constitui hoje a maior fonte de tecido humano arquivado. O DNA extraído de tecido parafinado por vezes não é adequado para as técnicas de biologia molecular, visto que se apresenta parcialmente degradado. OBJETIVOS: O objetivo desse estudo foi verificar se tecido humano de boca parafinado e arquivado pelos últimos 40 anos pode ser usado para a reação em cadeia da polimerase (PCR). MÉTODOS: Amostras foram submetidas à técnica de extração de DNA pelo método do fenol-clorofórmio. Para quantificação e qualificação do DNA foram realizadas análise em espectrofotômetro, eletroforese em gel de agarose e amplificação pela técnica da PCR. RESULTADOS: Foi observada fraca correlação positiva entre a quantidade de DNA obtida e a idade das amostras. A eletroforese em gel de agarose demonstrou que a maioria do DNA obtido foi constituída de fragmentos pequenos. O fragmento de 268-pb do gene da beta-globina foi amplificado em 55 por cento dos casos, preferencialmente nos casos mais recentes. O fragmento de 149-pb do gene WAF1 apresentou amplificação fraca, mas presente em 75 por cento dos casos. O fragmento de 536-bp do gene da beta-globina foi detectado em somente 25 por cento dos casos e também preferencialmente nos casos mais recentes. CONCLUSÕES: Esse estudo mostrou que, apesar de o DNA estar degradado, é possível usar DNA genômico extraído de tecido parafinado arquivado pelos últimos 40 anos em reações de PCR de produtos pequenos. A amplificação de produtos maiores, entretanto, é mais difícil.
Assuntos
Humanos , DNA , Fixação de Tecidos/métodos , Amplificação de Genes , Inclusão em Parafina , Reação em Cadeia da Polimerase/métodos , Análise de Sequência de DNARESUMO
Se describe un método simple rápido para el re-procesamiento de tejidos incluidos en parafina usados en microscopia electrónica de transmisión (MET) y de rastreo (MER). Los tejidos incluidos en parafina se seccionaron, desparafinaron en tolueno y se expusieron a vapores de osmio mediante irradiación con microorndas en horno de microondas doméstico. Los tejidos fueron embebidos en resina epóxica, polimerizados y seccionados. El método de procesamiento requirió un tiempo relativamente corto (aproximadamente 30 minutos para MET y 15 para MER) y rinde una calidad razonable de la ultraestructura para propósitos diagnósticos.
A simple and rapid method is described for re-processing of light microscopy paraffin sections to observe they under transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). The paraffin-embedded tissue is sectioned and deparaffinized in toluene; then exposed to osmium vapor under microwave irradiation using a domestic microwave oven. The tissues were embedded in epoxy resin, polymerized and ultrathin sectioned. The method requires a relatively short time (about 30 minutes for TEM and 15 for SEM), and produces a reasonable quality of the ultrastructure for diagnostic purposes.
Assuntos
Diagnóstico , Microscopia Eletrônica , Microscopia Eletrônica de Varredura , Parafina , Extratos de Tecidos , Costa RicaRESUMO
Spinal muscular atrophy (SMA) type I is a common severe autosomal recessive inherited neuromuscular disorder that has been mapped to chromosome 5q11.2-13.3. The survival motor neuron (SMN) gene, a candidate gene, is known to be deleted in 96% of patients with SMA type I. Presently, PCR and single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) analyses have been made possible for application to both archival slides and paraffin-embedded tissues. Archival materials represent valuable DNA resources for genetic diagnosis. We applied these methods for the identification of SMN gene of SMA type I in archival specimens for the prenatal diagnosis. In this study, we performed the prenatal diagnosis with chorionic villus sampling (CVS) cells on two women who had experienced neonatal death of SMA type I. DNA extraction was done from archival slide and tissue materials and PEP-PCR was performed using CVS cells. In order to identify common deletion region of SMN and neuronal apoptosis-inhibitory protein (NAIP) genes, cold PCR-SSCP and PCR-restriction site assay were carried out. Case 1 had deletions of the exons 7 and 8, and case 2 had exon 7 only on the telomeric SMN gene. Both cases were found to be normal on NAIP gene. These results were the same for both CVS and archival biopsied specimens. In both cases, the fetuses were, therefore, predicted to be at very high risk of being affected and the pregnancy were terminated. These data clearly demonstrate that archival slide and paraffin-embedded tissues can be a valuable source of DNA when the prenatal genetic diagnosis is needed in case any source for genetic analysis is not readily available due to previous death of the fetus or neonate.