RESUMO
Background: Mexico is innovating in the livestock industry through in vitro generation of bovine embryos with technologies such as well-of-the-well (WOW) and polyester mesh (PM) single-embryo culture systems. These techniques allow to maintain embryos in separate areas of a shared culture medium. Objective: To compare the quantity and quality of bovine embryos produced in WOW and PM culture systems versus the conventional (CG) culture system. Methods: In total, 345 embryos fertilized in vitro were evaluated for blastocyst yield in the three culture systems. To count blastocyst cell numbers, 69 embryos in each system were differentially stained for trophectoderm (TE), inner cell mass (ICM), and apoptotic cells. A qPCR gene expression analysis was performed for embryos in all three systems. Results: The WOW, PM and CG systems developed similar amount of blastocysts (41, 35 and 36%, respectively; p>0.05). Blastocysts in all three systems showed adequate amounts of ICM and apoptotic cells. Blastocysts in the PM system showed a greater number of TE cells [63.7 versus 58.6% in the CG system (p0.05). The ATP5B expression was higher in WOW than in PM (p0.05). The TJP3 expression was higher in PM than in WOW and CG (p<0.05). Expression of ID2 and CLDN4 was higher in WOW than in PM and CG (p<0.05). The biplot graphic from Principal Component Analysis (PCA) revealed that CG was located near degenerated embryos, whereas PM was located near arrested embryos, larger ICM and TE, and TJP3 expression. The WOW was located toward blastocysts, morulae, and expression of CLDN4, ID2 and GNAS. Conclusion: Compared with CG, both the PM and WOW systems are good options for culturing single embryos in the bovine model. Moreover, the PCA results suggest that embryos developed in the WOW system have greater capacity for generating blastocysts with increased ability to form TE and ICM layers, which might improve implantation.
Antecedentes: México está innovando en la industria ganadera a través de la generación in vitro de embriones bovinos con tecnologías de cultivo individual como lo son Pozo dentro de Pozo (WOW) y Malla de Poliéster (PM). Estos mantienen los embriones en áreas separadas mientras comparten un mismo medio de cultivo celular. Objetivo: Comparar la cantidad y calidad de embriones bovinos producidos en los sistemas WOW y PM contra el sistema de cultivo convencional en grupo (CG). Métodos: En total se evaluaron 345 embriones fertilizados in vitro para determinar la producción de blastocistos generados en los tres sistemas. Para contar el número de células por blastocisto, 69 embriones en cada sistema se tiñeron diferencialmente para trofectodermo (TE), masa celular interna (ICM) y células apoptóticas. Se realizó un análisis de expresión génica por qPCR de los embriones obtenidos en los tres sistemas. Resultados: Los sistemas WOW, PM y CG desarrollaron similares cantidades de blastocistos (41, 35 y 36%, respectivamente; p>0,05). Los blastocistos en los tres sistemas mostraron cantidades adecuadas de ICM y células apoptóticas. Los blastocistos en el sistema PM mostraron un mayor número de células TE [63,7% versus 58,6% en el sistema CG (p0,05). La expresión de ATP5B fue mayor en WOW que en PM (p<0,05), pero similar a CG (p<0,05). La expresión de TJP3 fue mayor en PM que en WOW y CG (p<0,05). La expresión de ID2 y CLDN4 fue mayor en WOW que en PM y CG (p<0,05). El gráfico de biplot del análisis de componentes principales reveló que CG se encontró cerca de embriones degenerados, mientras que PM se encontró cerca de embriones en arresto, ICM, TE, y TJP3. El WOW se localizó hacia blastocistos, mórulas y la expresión de CLDN4, ID2 y GNAS. Conclusión: En el modelo bovino los sistemas PM y WOW son buenas opciones para cultivar embriones individuales, ya que se obtienen resultados muy similares a los obtenidos con el sistema CG. Además, los resultados de PCA sugieren que los embriones individuales desarrollados en el sistema WOW generan blastocistos con mayor capacidad de formar TE e ICM, lo que podría mejorar su éxito de implantación.
Antecedentes: O México está inovando na indústria pecuária por meio da geração in vitro de embriões bovinos com tecnologias de cultura de embriões individuais, bem como em poço (WOW) e malha de poliéster (PM). Estes mantêm os embriões em áreas separadas, enquanto compartilham o mesmo meio de cultura de células. Objetivo: Comparar a quantidade e a qualidade de embriões bovinos produzidos nos sistemas de cultura WOW e PM com o sistema convencional de cultura em grupo (CG). Métodos: No total, 345 embriões fertilizados in vitro foram avaliados para determinar a produção de blastocistos gerados nos três sistemas. O número de células por blatocisto foi contado, 69 embriões em cada sistema foram diferencialmente corados para trofectoderme (TE), massa celular interna (ICM) e células apoptóticas. Uma análise de expressão gênica qPCR foi realizada para os embriões obtidos nos três sistemas. Resultados: Os sistemas WOW, PM e CG desenvolveram quantidades semelhantes de blastocistos (41, 35 e 36%, respectivamente; p>0,05). Os blastocistos nos três sistemas mostraram quantidades adequadas de ICM e células apoptóticas. Os blastocistos no sistema PM mostraram um número maior de células TE [63,7 versus 58,6% no sistema CG (p0,05). A expressão de ATP5B foi maior no WOW do que no PM (p<0,05), mas semelhante ao GC (p<0,05). A expressão de TJP3 foi maior no PM do que no WOW e CG (p<0,05). A expressão de ID2 e CLDN4 foi maior no WOW do que no PM e CG (p<0,05). O gráfico biplot da análise de componentes principais revelou que CG foi encontrado próximo a embriões degenerados, enquanto PM foi encontrado próximo a embriões presos, ICM, TE e TJP3. WOW foi encontrado para ter blastocistos, mórulas e a expressão de CLDN4, ID2 e GNAS. Conclusão: Em comparação com o CG, os sistemas PM e WOW são boas opções para a cultura de embriões individuais no modelo bovino. Além disso, os resultados da PCA sugerem que embriões individuais desenvolvidos no sistema WOW têm maior capacidade de desenvolver blastocistos com maior capacidade de formar as camadas TE e ICM, o que poderia melhorar seu sucesso de implantação.
RESUMO
In vitro embryo production (IVP) represents a way to increase gamete use from animals with high zootechnical value. In spite of the advances obtained in IVP over the last few years, production of transferable embryos is still low. The aim of this review is to discuss ways to produce in vitro embryos, as well as oocytes formation and maturation processes that can be related to the effectiveness of obtained results. Some studies show the influence of follicular growth factors, gonadotropins, steroids and other hormones on the follicular development and the quality of the cumulus oocyte complex (COC). The follicular phase of slow growth is critical for the development of the oocyte capacity to reach the final competence and diameter. Information about endocrine influences, or likewise, the dependence of growth of small antral follicles when a loss in the oocyte or follicle functionality occurs is scarce in the literature. A variable number of different techniques and protocols for treatment of oocytes donors are described with the aim of improve the results, the COCs recovering rate and the developmental competence in vitro of collected oocytes. From the considerations presented in this review, it is possible to verify the importance of better understanding the factors involved in the IVP process, with the aim of allow new alternatives to increase the results obtained in programs of animal assisted reproduction.
La producción in vitro de embriones (PIV) representa una manera de aumentar el uso de gametos de animales con alto valor zootécnico. A pesar de los avances obtenidos en PIV en los últimos años, la producción de embriones tranferibles sigue siendo baja. El objetivo de esta revisión es discutir maneras de producir embriones in vitro, así como los procesos de formación y de maduración de los oocitos que se pueden relacionar con la eficacia de los resultados obtenidos. Algunos estudios demuestran la influencia de los factores foliculares del crecimiento, gonadotrofinas, esteroides y otras hormonas en el desarrollo folicular y la calidad del complejo del cumulus oocito (CCO). La fase folicular del crecimiento lento es crítica para el desarrollo de la capacidad del oocito de alcanzar la capacidad y el diámetro final. Información sobre influencias endocrinas, o además, la dependencia del crecimiento de pequeños folículos antrales cuando ocurre una pérdida en la funcionalidad del oocito o del folículo, es escasa en la literatura. Un número variable de diversas técnicas y los protocolos para el tratamiento de oocitos de las donantes son descritos en esta revisión, con lo objetivo de mejorar los resultados, el índice de la recuperacion de CCOs y la capacidad de desarrollo in vitro de oocitos recogidos. De las consideraciones presentadas en esta revisión, es posible verificar la importancia de entender los factores implicados en el proceso de PIV, para permitir el desarrollo de nuevas alternativas que mejoren los resultados obtenidos en programas de la reproducción animal asistida.
A produção in vitro (PIV) de embriões representa uma maneira de incrementar o uso de gametas de animais de alto valor zootécnico. Apesar dos avanços obtidos na PIV nos últimos anos, a produção de embriões transferíveis ainda é baixa. O objetivo desta revisão é discutir maneiras de produzir embriões in vitro, assim como o processo de formação e maturação de oócitos, que pode estar relacionado a eficácia dos resultados obtidos. Aguns estudos demonstram a influência de fatores de crescimento, gonadotrofinas, esteróides e outros hormônios no desenvolvimento folicular e na qualidade do complexo cumulus oócito (CCO). A fase folicular de crescimento lento é critica para o desenvolvimento da capacidade do oócito de atingir a competência e o diâmetro finais. Informação sobre as influências endócrinas, ou seja, da dependência do crescimento de pequenos folículos antrais quando ocorre perda da funcionalidade do oócito ou folículo são escassas na literatura. Um número variável de diferentes técnicas e protocolos para o tratamento de doadoras de ovóctios são descritos com o objetivo de melhorar os resultados, a taxa de recuperação de CCOs e o desenvolvimento da competência in vitro dos oócitos coletados. Das considerações apresentadas nesta revisão é possível verificar a importância do conhecimento dos fatores envolvidos no processo de PIV, com o objetivo de possibilitar que novas alternativas incrementem os resultados obtidos em programas de reprodução animal assistida.