RESUMO
Los tratamientos de primera línea para la enfermedad de Chagas generan importantes efectos adversos que acentúan el deterioro de la salud en los pacientes. La necesidad de generar fármacos alternativos ha permitido desarrollar estudios donde se emplean parásitos capaces de expresar una proteína fluorescente, a fin de correlacionar fluorescencia con población de protozoarios. En este sentido, ideamos una metodología para el seguimiento de la proliferación de Trypanosoma cruzi-GFP (Green Fluorescent Protein) en modelos in vitro e in vivo, empleando el equipo iBox- UVP. Los ensayos in vitro se iniciaron con una curva de calibración usando concentraciones entre 5x105 y 5x107 parásitos/mL. Seguidamente, con una curva de proliferación evidenciamos a través de la fluorescencia la susceptibilidad de los parásitos frente a la droga comercial Benznidazol (IC50= 5,3±1,3 μM). En el ensayo in vivo se corroboró cualitativamente el efecto quimioterapéutico del Benznidazol (100 mg/kg/día) en ratones C57BL/6, partiendo de un inóculo de 2,5x105 parásitos, haciendo captura de imágenes de fluorescencia cada dos días a partir del día 1, e inicio del tratamiento por vía oral el sexto día. El coeficiente de correlación cercano a 1 obtenido en la curva de calibración habla de un método de cuantificación parasitario sencillo y robusto; también los ensayos en modelos in vitro e in vivo permitieron monitorear el efecto dosis-dependiente de Benznidazol sobre T. cruzi-GFP. En síntesis, elaboramos una metodología novedosa, rápida, no invasiva y que sigue en tiempo real la respuesta quimioterapéutica de drogas anti-T. cruzi.
The first-line treatments for Chagas disease generate significant adverse effects that accentuate the health deterioration in patients. The need to generate alternative drugs has led to the development of studies in which parasites will express a fluorescent protein, and correlate this expression with protozoan population. We devised a methodology for monitoring the proliferation of Trypanosoma cruzi- GFP (Green Fluorescent Protein) in models in vitro and in vivo, using the equipment iBox-UVP. In vitro assays were initiated with a calibration curve using concentrations between 5x105 and 5x107 parasites/mL. Subsequently, with a proliferation curve, through fluorescence we determined the susceptibility of the parasites against the commercial drug Benznidazol (IC50= 5,3±1,3 μM). In vivo assays corroborated qualitatively the chemotherapeutic effect of Benznidazol (100 mg/kg/day) in C57BL/6 mice, starting from an inoculum of 2.5x105 parasites, making capture of fluorescence imaging every two days from day 1, and starting oral treatment on the sixth day. The correlation coefficient close to 1 obtained in the calibration curve showed that this quantification method of parasites is simple and robust; assays in vitro and in vivo allowed monitoring dose-dependent effects of Benznidazol agains T. cruzi-GFP. We have produced an innovative, rapid, non-invasive method that monitors in real time the chemotherapeutic response of anti-T. cruzi drugs.
RESUMO
Las nanopartículas magnéticas (MNP) complejadas con vectores génicos pueden, en presencia de un campo magnético externo, amplificar sustancialmente la eficiencia de la transferencia génica. Esta técnica, denominada magnetofección, es de gran interés en el campo de la terapia génica. En este estudio se caracterizó la mejora de transferencia génica en células gliales B92 utilizando complejos constituidos por diferentes proporciones de MNP asociadas a dos vectores adenovirales, a saber: los complejos entre las MNP denominadas PEI-Mag2 asociadas al adenovector RAd-GFP que expresa la proteína fluorescente verde GFP o al adenovector RAd-DsRed que expresa la proteína fluorescente roja DsRed2. Se demostró que para ambos vectores, a medida que la relación MNP/partícula viral física (PVF) va aumentando, la amplificación de la transfección también aumenta hasta que se llega a una relación MNP/PVF a partir de la cual el factor de amplificación alcanza un plateau. Se determinó que para el complejo PEI-Mag2/RAd-GFP la relación a partir de la cual se alcanza el plateau es de aproximadamente 0,5 fg Fe/PVF mientras que para el complejo PEI-Mag2/RAd-DsRed, esta relación corresponde a aproximadamente 71 fg Fe/PVF. Se concluye que los dos complejos magnéticos estudiados representan promisorias herramientas para mejorar la eficiencia en la terapia génica en células cerebrales.
It is known that certain types of magnetic nanoparticles (MNPs) complexed to gene vectors can, in the presence of an external magnetic field, greatly enhance gene transfer into cells. This technique, called magnetofection, is of great relevance to gene therapy. In the present study the ability of MNP/adenovector complexes to enhance gene transfer to B92 glial cells was assessed. Two complexes were assessed, namely PEI-Mag2/RAd-GFP and PEI-Mag2/RAd-DsRed, which are constituted by the MNP PEI-Mag2 complexed to the adenovector RAd-GFP (expressing the green fluorescent protein GFP) and RAd-DsRed (expressing the red fluorescent protein DsRed2), respectively. It was shown that for both vectors, an increase in the ratio MNP/PVP (physical viral particle) is paralleled by an increase in transduction efficiency, up to a certain threshold value at which an efficiency plateau is reached. This threshold value was 0.5 fg Fe/PVP for the RAd-GFP complex and about 71 fg Fe/PVP for the RAd-DsRed complex. It can be concluded that both magnetic complexes assessed in this study represent promising tools for enhancing the efficiency of gene therapy in brain cells.
As nanopartículas magnéticas (MNPs) complexadas com vetores de genes podem, em presença de um campo magnético externo, aumentar consideravelmente a eficiência da transferência gênica. Esta técnica, chamada magnetofecção, é de grande relevância para a terapia genética. No presente estudo, foi caracterizada a melhoria de transferência de genes em células gliais B92 utilizando complexos constituídos por diferentes proporções de MNP associadas a dois vetores adenovirais, a saber: os complexos entre as MNP denominadas PEI-Mag2 associadas ao adenovetor RAd-GFP que expressa a proteína fluorescente verde GFP ou ao adenovetor RAd-DsRed que expressa a proteína fluorescente vermelha DsRed2. Foi demonstrado que para ambos os vetores, enquanto a relação MNP/partícula viral física (PVF) vai aumentando, a amplificação da transfecção também aumenta até que se chega a uma relação MNP/PVF a partir da qual o fator de amplificação alcança um limiar. Determinou-se que para o complexo PEI-Mag2/RAd-GFP a relação a partir da qual se atinge o limiar é de aproximadamente 0,5 fg Fe/PVF ao passo que para o complexo PEI-Mag2/RAd-DsRed, esta relação corresponde a aproximadamente 71 fg Fe/PVF. Conclui-se que os dois complexos magnéticos estudados representam promissoras ferramentas para melhorar a eficiência na terapia de genes em células cerebrais.