Diferentes métodos para aislamiento y detección de Salmonella spp. en canales porcinas / Different methods for isolation and detection of Salmonella spp. in pig carcasses

RESUMEN La Organización Mundial de la Salud (OMS) define salmonelosis como una de las enfermedades transmitida por alimentos (ETA) de mayor casuística, ampliamente extendida en todo el mundo. La enfermedad es producida por Salmonella spp. y causa una de las zoonosis más frecuentes y de mayor impacto económico. El hombre adquiere la infección después de la ingestión de alimentos contaminados, aunque también puede transmitirse de persona a persona o por vía fecal-oral. Actualmente, las técnicas micro-biológicas de aislamiento convencional para detección de Salmonella spp. son establecidas por el Código Alimentario Argentino para verificar la aptitud de un producto para consumo, pero éstas requieren de 4 a 5 días para la obtención de un resultado, tiempo que juega en contra para el productor y la conservación de dichos alimentos. Por este motivo en este trabajo se analizan los métodos de diagnóstico tradicional según Normas ISO 6579:2002 con algunas modificaciones, los métodos de inmunoensayo comerciales y la Reacción en Cadena de la Polimerasa técnica (PCR) de detección del gen invA implicado en el proceso de invasión de cepas patógenas. Se analizaron 60 muestras procedentes de canales porcinas destinadas a comercialización. Se detectó un 10% de Salmonella spp. Se pudo determinar que el diagnóstico molecular por PCR posee alta sensibilidad, pero no es alentador el resultado que reflejan los test comerciales inmunocromatográficos ya que queda en evidencia la necesidad de alta carga microbiana para un diagnóstico certero.

ABSTRACT The World Health Organization (WHO) defines salmonellosis as one of the most important foodborne diseases, widely spread worldwide. The disease is produced by Salmonella spp. and causes one of the most frequent zoonoses and of greater economic impact. The infection is acquired after ingestion of contaminated food, although it can also be transmitted from person to person or by fecal-oral route. Currently, conventional isolation microbiological techniques for detection of Salmonella spp. are established by the Argentine Food Code to verify the suitability of a product for consumption. But microbiological techniques require 4 to 5 days to obtain a result, time that plays against the producer and the conservation of such foods. For this reason in this work we analyze the traditional diagnostic methods according to ISO standards 6579: 2002 with some modifications, the commercial immunoassay methods and the Polymerase Chain Reaction technique (PCR) detection of the invA gene involved in the process of invasion of pathogenic strains. Sixty samples from pigs destined for commercialization were analyzed. 10% of Salmonella spp. was detected. It was possible to determine that the molecular diagnosis by PCR has high sensitivity, but it is not encouraging the result that reflect the commercial immunochromatographic tests since it is evident the need of high microbial load for a correct diagnosis.

Phenotypic characterization of canine Malassezia spp., isolates / Caracterización fenotípica de aislamientos de Malassezia spp., de origen canino

ABSTRACT Objective . To characterize and identify yeasts of the genus Malassezia by phenotypic features. Materials and methods. First, the macroscopic and microscopic morphological characteristics were described. In addition we performed biochemical and physiological assays as Tweens and Cremophor, including more. Results. Our results evidenced of 105 isolates obtained from dogs diagnosed with external otitis, it was possible to identify two distinct species from 46 isolates within the Malassezia genus: 36.19% (n=38) were identified as M. pachydermatis and 7.62% (n=8) as M. furfur. According to phenotypic patterns the remaining 56.19% (n=59) were reported as Malassezia spp., possibly corresponding to M. furfur and/or M. pachydermatis. Conclusions. Results emphasize the necessity to characterize according to species. It is not feasible to define Malassezia by species based on morphological, biochemical, and physiological findings. Therefore, molecular genotyping should be performed to identify markers allowing a more precise isolate identification. This would broaden our epidemiological knowledge regarding different species involved in canine otitis pathologies.

RESUMEN Objetivo . Caracterizar e identificar levaduras del género Malassezia, mediante características fenotípicas. Materiales y métodos . Inicialmente se describieron las características morfológicas macroscópicas y microscópicas, adicionalmente se realizaron pruebas bioquímicas y fisiológicas como Tween y Cremophor, entre otras. Resultados . De 105 aislamientos de caninos diagnosticados previamente con otitis, 46 fueron caracterizados hasta especie, así: El 36.19% (n=38) correspondió a M. pachydermatis, el 7.2% (n=8) a M. furfur; y 56.19% (n=59) restante fueron reportados como Malassezia spp., debido a los patrones fenotípicos atípicos que presentaron, y que podrían corresponder a variantes de M. furfur y/o M. pachydermatis. Conclusión. Estos resultados enfatizan la necesidad de hacer una caracterización a nivel de especie y/o genotipos mediante marcadores moleculares que permitan una identificación más precisa de los aislamientos. Con el presente estudio, se contribuye al conocimiento de las diferentes especies involucradas en patologías óticas en caninos.

Pruebas bioquímicas tradicionales y de alta resolución para identificación manual de enterobacterias / Traditional and high-resolution biochemical tests for manual identification of enterobacteria / Provas bioquimicas tradicionais e de alta resolução para identificação manual de enterobacterias

Se comparó una serie tradicional de pruebas bioquímicas con una de alta resolución para identificar 500 cepas de enterobacterias utilizando un método probabilístico para interpretar los resultados. La serie tradicional estuvo formada por 10 pruebas (producción de ornitina descarboxilasa, lisina descarboxilasa, lisina desaminasa, ácido sulfhídrico, indol y gas, hidrólisis de urea, utilización de citrato y de malonato, y movilidad). La serie de alta resolución, también con 10 pruebas, se integró con las primeras 4 mencionadas en la serie tradicional y 6 de fermentación de hidratos de carbono (adonitol, L-arabinosa, celobiosa, L-ramnosa, rafinosa y sorbitol). Con la serie de alta resolución se asignaron identidades únicas a 445 cepas (351 con probabilidad de 1,0 y 94 con probabilidades entre 0,010 y 0,999), y de las restantes 55 cepas, a 53 y 2 se asignaron dos y tres identidades probables respectivamente. Con la serie tradicional se asignaron identidades únicas a 306 cepas (110 con probabilidad de 1,0 y 196 con probabilidades entre 0,001 y 0,999) y a 179 y 5 se asignaron dos y tres identidades probables respectivamente. Diez cepas no se pudieron identificar. Todos los indicadores analizados revelaron la superioridad de la serie de alta resolución. El método probabilístico permitió la comparación objetiva de ambas series.

A traditional series of biochemical tests-was compared to a high-resolution one in order to identify 500 strains of enterobacteria, using a probabilistic method for the interpretation of experimental results. The traditional series was formed by 10 tests (ornithine decarboxylase, lysine decarboxylase, lysine deaminase, sulfhydric acid, indol and gas production, urea hydrolysis, citrate and malonate utilization, and motility). The high-resolution one was also formed by 10 tests, including the first 4 tests mentioned above and 6 carbohydrate fermentation tests (adonitol, L-arabinose, cellobiose, L-rhamnose, raffinose, and sorbitol). With the high-resolution series, single identities were assigned to 445 strains (351 with a probability of 1.0 and 94 with probabilities in the range 0.010-0.999), and for the remaining strains two and three probable identities were assigned to 53 and 2 strains, respectively. With the traditional series, single identities were assigned to 306 strains (110 with a probability of 1.0 and 196 with probabilities in the 0.001-0.999 range), two and three probable identities were assigned to 179 and 5 strains respectively; 10 strains turned out to be non-identifiable. Every parameter of comparison used revealed the superiority of the high-resolution series. The probabilistic method for interpretation of experimental results allowed an objective comparison of both series.

Foi comparada uma série tradicional de testes bioquímicos com uma outra de alta resolução para identificar 500 cepas de enterobactérias usando uma abordagem probabilística para a interpretação dos resultados. A série tradicional consistiu em 10 testes (produção de ornitina descarboxilase, lisina descarboxilase, lisina desaminase, ácido sulfídrico, indol e gás, hidrólise da ureia, utilização de citrato e de malonato, e mobilidade). A série de alta resolução, também com 10 ensaios, integrou-se com as primeiras 4 mencionadas na série tradicional e 6 de fermentação de hidratos de carbono (adonitol, L-arabinose, celobiose, L-ramnose, rafinose e sorbitol). Com a série de alta resolução foram atribuídas identidades únicas a 445 cepas (351, com probabilidade 1,0, e 94, com probabilidade entre 0,010 e 0,999), e das restantes 55 cepas, a 53 e 2 foram atribuídas duas e três identidades possíveis, respectivamente. Com a série tradicional foram atribuídas identidades únicas a 306 cepas (110 com probabilidade de 1,0 e 196 com probabilidades entre 0,001 e 0,999) e a 179 e 5 foram atribuídas duas e três identidades prováveis, respectivamente. Dez cepas não puderam ser identificadas. Todos os indicadores analisados demonstraram a superioridade da série de alta resolução. O método probabilístico permitiu a comparação objetiva de ambas as séries.

Identificación de micobacterias no tuberculosas: comparación de métodos bioquímicos y moleculares / Identification of non-tuberculosis mycobacteria: comparison between biochemical and molecular methods

Las infecciones causadas por micobacterias no tuberculosas (MNT) o atípicas constituyen en la actualidad un grave problema de salud, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Estas micobacterias presentan patrones de susceptibilidad a antibióticos particulares y distintos a M. tuberculosis, por lo que la administración del tratamiento adecuado requiere de un método rápido, sencillo y sensible de identificación. La técnica de PRA (Análisis de Restricción de Productos de PCR), basada en la digestión enzimática del producto de amplificación del gen hsp65, ha mostrado ser un método adecuado de identificación de micobacterias. En el presente trabajo se comparó la técnica de PRA con el estándar de identificación de micobacterias representado por las pruebas bioquímicas en 30 aislados provenientes del Laboratorio de Tuberculosis del Instituto de Biomedicina. La técnica de PRA permitió identificar 96% de las cepas analizadas, en comparación con 92.% de cepas identificadas por las técnicas bioquímicas. Los resultados obtenidos fueron idénticos en 18 de 22 cepas, correspondiendo al 82% de los resultados. Se concluye que el PRA es un método rápido, sencillo y económico que produce resultados concordantes con las técnicas tradicionales, con un menor grado de error. Basados en estos resultados se recomienda el uso del PRA en los laboratorios clínicos como método de identificación de rutina para micobacterias.

Infections caused by atypical mycobacteria at present constitute a serious health problem, especially in immunocompromised patients. These mycobacteria present particular susceptibility patterns, different from M. tuberculosis, due to which the administration of an adequate treatment requires a fast, simple and sensitive identification method. The PRA technique (PCR Restriction), based on the enzymatic digestion of the amplification product of the hsp65 gene has shown to be an adequate method for the identification of mycobacteria. In this study we compared the PRA technique with the standard mycobacterial identification method, represented by biochemical tests, in 30 isolates from the Tuberculosis Laboratory of the Instituto de Biomedicina. The PRA technique allowed the identification of 96% of the strains analyzed, as compared with 92% of strains identified through biochemical methods. The results obtained were identical in 18 of 22 strains, corresponding to 82% of the results. It is concluded that the PRA technique is a fast, simple and economical method that produces results in concord with traditional techniques, with a lesser degree of error. Based in these results, the use of PRA as routine identification technique for mycobacteria is recommended for clinical laboratories.

Estudio preliminar del retardo mental en la población de Rovira (Tolima, Colombia) / Preliminary study of mental retardation in Rovira (Tolima, Colombia)

El retardo mental se caracteriza por limitaciones en el desempeño como resultado de significativas deficiencias de la inteligencia y la conducta adaptativa. En Colombia, la mayor parte de los pacientes con esta alteración no reciben evaluación genética. El objetivo de este trabajo es evaluar y caracterizar el retardo mental en un grupo de personas con esta condición en la población de Rovira (Tolima) e identificar los posibles factores asociados. La metodología consistió en realizar un diagnóstico clínico preliminar de 25 pacientes con retardo mental y realizar la correspondiente toma de muestras de sangre y orina para efectuar los exámenes correspondientes. Se realizaron estudios bioquímicos (cloruro férrico, nitrosonaftol, nitroprusiato de sodio, benedict, cromatografía para la detección de aminoácidos y carbohidratos) y citogenéticos (Bandeo G). Para la detección de plaguicidas, se realizó un muestreo aleatorio en diferentes puntos de todo el recorrido del sistema de distribución de agua y ciertos lugares del centro del municipio de Rovira. Con este fin, se recolectaron 20 muestras de agua y 20 muestras de tomate, elegidas al azar, de los diferentes sitios de distribución y cultivos de la hortaliza. Se identificó una familia de tres hijos afectados (dos mujeres y un hombre) con retardo mental, lo cual sugiere un componente genético en este caso. Las pruebas metabólicas fueron negativas y los cariotipos normales. Se plantea la necesidad de realizar pruebas moleculares que incluyan el síndrome de X-frágil para complementar el estudio y realizar consejería genética. En cuanto a los resultados y el análisis pertinente de las muestras para organofosforados, el 100% de éstas resultaron positivas. Se reportó un 60% de positividad en las muestras de agua y del 100% en las muestras de tomate, para el caso de los carbamatos; sin embargo, para el caso de los organoclorados, el 100% de las muestras estudiadas resultaron negativas.

Mental retardation is characterized by limitations in performance, significant deficiency in intelligence and adaptative behavior, causing clinical and social disability. Most patients with mental retardation in Colombia do not receive clinical genetics evaluation. The aims of the present study are to evaluate and characterize a group of patients with mental retardation from the population of Rovira. The present study included twenty five patients with mental retardation from Rovira (Tolima) which were studied by clinical examination, metabolic screening (ferric chloride, nitrosonaphtol, silver nitroprusiate, dinitrophenylhydrazine and benedict) and cytogenetics (G-Banding kariotype). Pesticide detection was perfomed by random sampling of water and tomatoes in twenty different places of water distribution, the center of the town and crop fields. A family with three affected sibs (two females, one male) with mental retardation was identified, suggesting a genetic component. Metabolic screening was negative and karyotypes were normal. The analyses performed for organophosphates were positive in 100% of the samples. Carbamates were positive in 60% of the water source and 100% of tomato samples. All the samples tested were negative for organochlorides. Further studies as molecular fragile-X test, will be performed.

Aplicación de RPC-PLFR en el diagnóstico de micobacterias no tuberculosas / Application of PCR-RFLP in the diagnosis of non-tuberculous mycobacteria

La amplificación por reacción de la polimersa en cadena (RPC) de un fragmento del gen hsp65, seguido del análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (PLFR) por las enzimas BstEll y Haelll, ha demostrado ser muy útil en la identificación de micobacterias no tuberculosas (MNT). En el presente trabajo se les realizó una batería de pruebas bioquímicas así como la RPC-PLFR a un total de 13 cepas de referencia y 46 cepas recibidas en el laboratorio. Los resultados de las pruebas bioquímicas estuvieron disponibles entre 4 a 6 semanas, a diferencia de la RPC-PLFR que requirieron de sólo 48 horas. En ambos métodos, las especies detectadas con mayor frecuencia fueron Mycobacetrium intracellulare, M. kansasii y M. fortuitum. La RPC-PLFR es un método rápido, sencillo y eficaz. Su aplicación en los Laboratorios de Referencia pudiera ser de gran utilidad para el diagnóstico de MNT.

The amplification of a fragment from hsp65 gene by polymerase chain reaction (PCR) followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis with BstEll and Haelll restriction enzymes has demonstrated to be very useful for identification of Non-Tuberculous Mycobacteria (NTM). The biochemical tests as well as the PCR-RFLP were carried out in 13 reference strains and 46 strains received in the laboratory. The results by biochemical tests were available in 4-6 weeks whereas the PCR-RFLP only required 48 hours. In both methods, Mycobacterium intracellulare, M. kansasii and M. fortuitum were the most frequently detected species. The PCR-RFLP method is fast, cheap and simple. Its application in Reference Laboratories could be very useful for diagnosis of NTM.