RESUMO
Resumen La uroporfirinógeno descarboxilasa humana (UROD-h) es la quinta enzima del camino biosintético del hemo y su actividad deficiente, relacionada a mutaciones en su gen, se encuentra asociada a un subgrupo de porfirias. El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación entre la dimerización de la enzima y su actividad enzimática y comprobar si la dimerización de UROD-h es imprescindible tanto para la primera etapa de la reacción (urogen→heptagen), como para la segunda etapa (heptagen→coprogen). Con ese objetivo, se expresó y purificó la UROD-h hasta homogeneidad, se analizó el comportamiento dímero-monómero bajo distintas condiciones que pudieran desplazar el equilibrio de dimerización y se evaluó la actividad enzimática en dichas condiciones. Los resultados obtenidos sugieren que la especie activa para la primera etapa de la reacción es el homodímero y que tanto el dímero como el monómero se comportan como especies activas para la segunda etapa de la reacción. Se propone que mutaciones clínicas como la Y311C, existentes en pacientes con porfiria cutánea tarda, podrían afectar la estabilidad del dímero y podrían ser el blanco para futuras terapias génicas.
Abstract Human uroporphyrinogen decarboxylase (UROD-h) is the fifth enzyme in the heme biosynthetic pathway and its deficient activity, related to mutations in its gene, is associated with a subset of porphyrias. The objective of this work was to study the relationship between the dimerisation of the enzyme and its enzymatic activity and to verify if the dimerisation of UROD-h is essential both for the first stage of the reaction (urogen→heptagen), and for the second stage (heptagen→ coprogen). With this objective, the UROD-h was expressed and purified to homogeneity, the dimer- monomer behaviour was analysed under different conditions, which could shift the dimerisation equilibrium, and the enzymatic activity was evaluated under these conditions. The results obtained suggest that the active species for the first stage of the reaction is the homodimer, and both the dimer and the monomer behaved as active species for the second stage of the reaction. It is proposed that clinical mutations such as Y311C, existing in porphyria cutanea tarda patients, could affect dimer stability and could be the target of future gene therapies.
Resumo A enzima uroporfirinogênio descarboxilase humana (UROD-h) é a quinta enzima da via biossintética do heme e sua atividade deficiente, relacionada com mutações em seu gene, está associada a um subgrupo de porfirias. O objetivo deste trabalho foi estudar a relação entre a dimerização da enzima e sua atividade enzimática e comprovar se a dimerização da UROD-h é imprescindível tanto para a primeira etapa da reação (urogênio→heptagênio), quanto para a segunda etapa (heptagênio→coprogênio). Com esse objetivo, a UROD-h foi expressa e purificada até a homogeneidade, o comportamento de dímero-monômero foi analisado sob diversas condições, que puderam deslocar o equilíbrio de dimerização, e a atividade enzimática foi avaliada em tais condições. Os resultados obtidos sugerem que a espécie ativa para a primeira etapa da reação é o homodímero, e tanto o dímero quanto o monômero se comportam como espécies ativas para a segunda etapa da reação. Propõe-se que mutações clínicas como Y311C, existentes em pacientes com porfiria cutânea tardia, poderiam afetar a estabilidade do dímero e poderiam ser o alvo de futuras terapias gênicas em porfiria cutânea tardia.
RESUMO
Abstract Biological homochirality is modelled using chemical reaction mechanisms that include autocatalytic and inhibition reactions as well as input and output flows. From the mathematical point of view, the differential equations associated with those mechanisms have to exhibit bistability. The search for those bifurcations can be carried out using stoichiometric network analysis. This algorithm simplifies the mathematical analysis and can be implemented in a computer programme, which can help us to analyse chemical networks. However, regardless of the reduction to linear polynomials, which is made possible by this algorithm, in some cases, the complexity and length of the polynomials involved make the analysis unfeasible. This problem has been partially solved by extending the stoichiometric matrix with rows that code the duality relations between the different reactions occurring in the network given as input. All these facts allow us to analyse 28 different network models, highlighting the basic requirements needed by a chemical mechanism to have spontaneous mirror symmetry breaking.
Resumen El origen de la homoquiralidad biológica se ha modelado usando mecanismos de reacción con pasos autocatalíticos, de inhibición y flujos de entrada y salida. Desde el punto de vista de las matemáticas, las ecuaciones diferenciales asociadas a tales mecanismos deben exhibir biestabilidad. La búsqueda de tales bifurcaciones se puede hacer usando el análisis de redes estequiométricas. Tal algoritmo facilita el trabajo matemático y se puede implementar en un programa de computadora, con lo que se simplifica el análisis y ayuda a entender y mejorar los mecanismos de reacción. No obstante, y a pesar de la reducción en la complejidad que es alcanzada usando el análisis de redes estequiométricas, la dificultad y la longitud de los polinomios involucrados hacen que, en los casos más difíciles y de mayor envergadura, la solución de estos no sea posible. En este trabajo se ha superado parcialmente el problema, adicionando a la matriz estequiométrica un conjunto de filas que codifican la relación de dualidad entre las diferentes reacciones presentes en la red química dada como entrada al programa. Así, hemos logrado analizar 28 modelos diferentes de homoquiralidad biológica, extrayendo de ellos el conjunto de requisitos necesarios para tener un modelo cinética y termodinámicamente consistente.
Resumo A origem da homoquiralidade biológica foi modelada usando mecanismos de reação com etapas autocatalíticas, de inibição e fluxos de entrada e saída. Do ponto de vista da matemática, as equações diferenciais associadas a tais mecanismos devem ser instáveis. A instabilidade pode ser estudada usando o algoritmo de análise de redes estequiométricas. Tal algoritmo facilita o trabalho matemático e pode ser implementado num programa de computador, o que simplifica a análise e ajuda a entender e melhorar os mecanismos de reação. No entanto, e apesar da redução na complexidade que é alcançada usando a análise de redes estequiométricas, a complexidade e comprimento dos polinômios envolvidos fazem que, nos casos mais complexos e de maior envergadura, a solução dos mesmos não seja possível. Neste trabalho, o problema foi superado, parcialmente, adicionando à matriz estequiométrica um conjunto de linhas que codificam a relação de dualidade entre as diferentes reações presentes na rede química dada como entrada ao programa. Desta forma foi possível analisar 28 modelos diferentes de homoquiralidade biológica, extraindo deles o conjunto de requisitos necessários para ter um modelo cinético e termodinamicamente consistente.
RESUMO
Abstract CHEMicalKINetics SimuLATOR (Chemkinlator) is a Graphical User Interface for the simulation of reaction mechanisms. The interface allows the user to see and change the parameters of a reaction network within a single window. Chemkinlator comes with built-in support for three types of kinetic simulations: Time Series, which computes the concentration of all species in an interval of time for the defined model; Bifurcation diagrams, which are the result of running several Time Series simulations over gradually different kinetic rate constants; and Flow/Temperature time series, which takes into account the effect of flow in the Continuous-flow well-Stirred Tank Reactor, and the effect of temperature on the rates constants according to the Arrhenius equation. In our research group, Chemkinlator has been the primary tool used to test the predictions made by algorithms that analyze homochirality phenomena. Chemkinlator is written in C++14 and Qt, and it uses the Fortran subroutine DLSODE to solve the differential equations associated with the reaction networks. Chemkinlator is open source software under the Apache 2.0 license and can be downloaded freely from https://gitlab.com/homochirality/chemkinlator.
Resumen CHEMical KINetics SimuLATOR (Chemkinlator) es una interfaz gráfica para realizar simulaciones de mecanismos de reacción. La interfaz le permite al usuario ver y cambiar los parámetros de una red de reacciones en una única ventana. Chemkinlator puede realizar tres tipos de simulaciones cinéticas: Time Series, calcula la concentración de cada especie en un intervalo de tiempo del modelo estudiado; Bifurcation, es el resultado de ejecutar varias veces las simulaciones del modo Time Series, cambiando gradualmente diferentes constantes de velocidad; y Flow/ Temperature es una serie de tiempo en la que se tiene en cuenta el efecto del flujo considerando un Reactor de Flujo Continuo bien Agitado y el efecto de la temperatura sobre las constantes de velocidad según la ecuación de Arrhenius. En nuestro grupo de investigación, Chemkinlator ha sido la herramienta principal para verificar las predicciones hechas por los algoritmos que analizan el fenómeno de homochiralidad. Chemkinlator está escrito en C++14 y Qt, y usa la subrutina de Fortran DLSODE para resolver las ecuaciones diferenciales relacionadas con los mecanismos de reacción. Chemkinlator es software de código abierto bajo la licencia Apache 2.0 y se puede descargar libremente de https://gitlab.com/homochirality/chemkinlator.
Resumo O CHEMical KINetics SimuLATOR (Chemkinlator) é uma interface gráfica para realizar simulações de mecanismos de reação. A interface permite ao usuário visualizar e alterar os parâmetros de uma rede de reação em uma única janela. O Chemkinlator pode realizar três tipos de simulações cinéticas: Time Series, calcula a concentração de cada espécie em um intervalo de tempo do modelo estudado; Bifurcation, é o resultado de executar várias vezes as simulações do modo Time Series, modificando gradualmente diferentes constantes de velocidade; e Flow/Temperature é uma serie de tempo que se considera o efeito do fluxo considerando um Reator de Fluxo Continuo bem Agitado e o efeito da temperatura sobre as constantes de velocidade pela equação de Arrhenius. No nosso grupo de investigação, o Chemkinlator tem sido a principal ferramenta para verificar as predições realizadas pelos algoritmos que analisam o fenómeno de homoquiralidade. O Chemkinlator está escrito em C++14 e Qt, e usa a sub-rotina de Fortran DLSODE para resolver as equações diferenciais relacionadas com os mecanismos de reação. O Chemkinlator é um software de código aberto baixo a licença Apache 2.0 e pode ser descarregado livremente em https://gitlab.com/homochirality/chemkinlator.