Criopreservación de semen de bagre rayado Pseudoplatystoma magdaleniatum con tres diferentes crioprotectores / Evaluation of three cryoprotectants to preserve striped catfish (Pseudoplatystoma magdaleniatum) semen

RESUMEN El objetivo fue criopreservar semen de bagre rayado Pseudoplatystoma magdaleniatum con tres crioprotectores internos diferentes: dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida (DMA) y etilenglicol (ETG) a dos porcentajes de inclusiones (5 y 10%), combinados con glucosa 6%, leche en polvo descremada 3% y vitamina E (0,4%). Cinco machos en fase de espermiación fueron inducidos con 0,4 ml de Ovaprim®/Kg. El semen fue diluido en la solución crioprotectora (1:3) en tubos de 2,5 ml, congelado en vapores de nitrógeno y descongelado a 35°C durante 90 segundos. El análisis estadístico incluyó un diseño factorial 3x2 y semen fresco (SF) como tratamiento testigo. En semen fresco, precongelado y descongelado se evaluó la movilidad total (Mt), tipos de movilidad, progresividad total y velocidades espermáticas con la ayuda de Sperm Class Analyzer SCA®. El SF registró volumen de 6,1±4,3 ml, Mt de 72,6±17,1%, activación de 31,2±2,1 segundos y concentración espermática de 54,7±22,9 millones/μl. En semen precongelado, el crioprotector (p<0,05) y porcentaje de inclusión (p<0,01), pero no su interacción, tuvieron un efecto significativo en la Mt, velocidad curvilínea (VCL) y velocidad lineal (VSL); mientras que en semen descongelado sólo la interacción de los factores (p<0,05) fue significativa en Mt, porcentajes de espermatozoide estáticos y VCL. La Mt cayó entre 36-67% en semen precongelado y entre 7486% en semen descongelado con relación a SF. Los resultados sugieren que DMSO, DMA y ETG incluidos a 5 o 10%, combinados con leche en polvo 3%, glucosa 6% y vitamina E 0,4% son alternativas viables de criopreservación del semen de bagre rayado.

ABSTRACT The objective of this study was to evaluate three internal cryoprotectants to preserve semen of striped catfish (Pseudoplatystoma magdaleniatum). The cryoprotectants tested were: dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylacetamide (DMA) and ethylene glycol (ETG) at two inclusion percentages (5 and 10%), mixed with 6% glucose, 3% skim milk powder, and 0.4% vitamin E. Five males in the spermiation phase were induced with Ovaprim® (0.4 ml/kg). The semen was diluted in the cryoprotective solution (1: 3) in 2.5 ml tubes, frozen in nitrogen vapors and thawed at 35°C for 90 seconds. A 3x2 factorial design was used, and the control treatment was fresh semen (SF). Total motility (Mt), type of motility total progressivity, and spermatic velocities were evaluated in fresh, pre-frozen and post-thawed semen using the Sperm Class Analyzer (SCA®) software. The SF volume was 6.1 ± 4.3 ml, with Mt of 72.6 ± 17.1%, activation of 31.2 ± 2.1 seconds and sperm concentration of 54.7 ± 22.9 million/μl. In the pre-frozen semen, the cryoprotectant (p <0.05) and the percentage of inclusion (p <0.01) -but not their interaction- had a significant negative effect on Mt, curvilinear velocity (VCL), and linear velocity (VSL); whereas in thawed semen only the interaction of the factors (p <0.05) was significant for Mt, static sperm percentages and VCL. The Mt decreased between 36-67% in pre-frozen semen and between 74-86% in thawed semen compared to SF. These results suggest that 5 or 10% inclusion levels of DMSO, DMA, and ETG, in combination with 3% powdered milk, 6% glucose, and 0.4% vitamin E are viable alternatives to cryopreserve semen of striped catfish.

Mini-percoll gradient may be used for frozen-thawed sperm selection in sheep / Gradiente de mini-Percoll pode ser utilizado na seleção espermática de sêmen congelado de ovinos

This study evaluated the effect of increasing centrifugal force and reducing centrifugation time and volume in Percoll protocols on ram sperm parameters. Commercial semen of Santa Inês rams were used and five treatments were performed: traditional Percoll and mini-Percoll (MP) techniques (I- 5000 x g, 5min; II- 2500 x g, 5min; III- 1250 x g, 5min; IV- 700 x g, 10min). At post-thawing (PT) and post-selection protocols (0h), samples were assessed for spermatozoa recovery rate, motility, plasma membrane (PM) integrity, sperm capacitation and morphology and incubated at 37 C for 1, 2 and 3h. The sperm recovery rate averaged 9.1±1.4%, and most motility parameters were similar (P> 0.05) among protocols. VCL (µm/s) was higher (P< 0.05) after MP-II, III and IV (66.1±4.5) than traditional Percoll (46.3±4.9). Capacitation status and PM integrity were similar (P> 0.05) among treatments. For the first time, we have demonstrated the reduction of the gradient volume and centrifugation time associated with an increase on centrifugation force at Percoll can be successfully used for frozen-thawed ram sperm selection. MP may be used instead of traditional Percoll, decreasing costs and semen handling time.(AU)

O presente estudo avaliou o efeito do aumento da força de centrifugação, bem como da redução do tempo de centrifugação e do volume do gradiente de Percoll em diferentes protocolos nos parâmetros espermáticos de ovinos. Foi utilizado sêmen comercial de carneiros da raça Santa Inês, e cinco tratamentos foram realizados: Percoll tradicional e quatro técnicas de mini-Percoll (I- 5000 x g, 5min; II- 2500 x g, 5min; III- 1250 x g, 5min; IV- 700 x g, 10min). Após o descongelamento e a seleção espermática em cada técnica utilizada (0h), amostras foram avaliadas quanto à taxa de recuperação espermática, motilidade, integridade de membrana plasmática, capacitação e morfologia. Ao final, foram incubadas a 37 ºC por uma, duas e três horas. A taxa de recuperação média (9,1±1,4%) e a maioria dos parâmetros de motilidade foram similares (P>0,05) entre os tratamentos. VCL foi maior (P<0,05) após MP-II, III e IV (66,1±4,5) quando comparados ao Percoll tradicional (46,3±4,9). O status da capacitação e a integridade de membrana foram similares (P>0,05) entre os tratamentos. Pela primeira vez, foi demonstrado que a redução do volume do gradiente utilizado e do tempo de centrifugação, associada com o aumento da força de centrifugação nos protocolos de Percoll, pode ser usada com sucesso na seleção espermática de sêmen congelado de ovinos. O mini-Percoll pode ser utilizado em alternativa à técnica de Percoll tradicional, diminuindo custos e tempo de manipulação do sêmen durante a técnica.(AU)

Effect of sperm selection techniques in frozen/thawed cat spermatozoa on sperm motility analyzed by CASA system / Efecto de técnicas de selección espermática en espermatozoides congelados/descongelados de gato sobre la motilidad espermática analizada mediante sistema CASA

SUMMARY: Freeze/thawing process reduces sperm survival and fertilizing ability of cat spermatozoa, with sperm motility being the most sensitive sperm parameter altered, due to cryo-damage. In this context, swim-up and density gradient processing methods can help to recover high motile and normal spermatozoa. Maximizing the use of frozen semen sample is essential, especially in endangered felids or high value cats in which sample size, number of samples or access to semen collection is reduced. To our knowledge, there is no previous report describing an in depth analysis of sperm motility improvement, after sperm selection techniques in frozen cat semen. Accordingly, we evaluated the effect of percoll gradient (PG) and swim up (SU) sperm selection techniques on sperm motility parameters and sperm recovery rate in frozen/thawed spermatozoa of domestic cat. Next, we evaluated the individual effect of the cat over sperm motility after PG sperm selection of frozen/thawed spermatozoa. SU and PG improved significantly all sperm motility parameters of frozen/thawed cat spermatozoa compared to simple washing. However, PG allows better sperm recovery from the original frozen sample and works mostly homogeneously among individual cats. This new information could help to maximize the use of frozen semen in endangered felids or high value domestic cats for its subsequent application on in vitro fertilization and artificial insemination.

RESUMEN: El proceso de congelación/descongelación reduce la sobrevivencia espermática y la habilidad para fertilizar en los espermatozoides de gato, siendo la motilidad espermática el parámetro más sensiblemente alterado debido al daño por frío. En este contexto, los métodos de procesamiento de swim-up y gradiente de densidad pueden ayudar a recuperar los espermatozoides normales y de alta motilidad. Maximizar el uso de una muestra de semen congelado es esencial, especialmente en felinos amenazados o en gatos de alto valor en los cuales el tamaño de muestra, número de muestras o el acceso a la colecta de semen son reducidos. Para nuestro conocimiento, no hay reportes previos que describan un análisis profundo del mejoramiento de la motilidad luego de técnicas de selección espermática en semen congelado de gato. De acuerdo a esto, evaluamos el efecto de las técnicas de selección espermática gradiente de percoll (PG) y swim up (SU) sobre los parámetros de motilidad y porcentaje de recuperación de espermatozoides congelados/descongelados de gato doméstico. Luego, evaluamos el efecto individual del gato sobre la motilidad espermática luego de la selección espermática con PG en espermatozoides congelados/descongelados. SU y PG mejoraron significativamente todos los parámetros de motilidad espermática de los espermatozoides congelados/descongelados comparado con el lavado simple. Sin embargo, PG permitió una mejor recuperación de espermatozoides desde la muestra congelada original y funcionó en su mayoría de manera homogénea entre los gatos individualmente. Esta nueva información puede ayudar a maximizar el uso del semen congelado en felinos amenazados o en gatos de alto valor para su posterior aplicación en fecundación in vitro e inseminación artificial.

Efeito do tipo de envase, flatpacks ou palhetas, sobre a criopreservação da fração rica do sêmen asinino / The effect of the type of package, FlatPacks or straws, on cryopreservation of the jackass sperm-rich fraction

Com o objetivo de se estudar o efeito do tipo de envase sobre a criopreservação do sêmen asinino, coletado de forma fracionada, utilizou-se o sêmen de cinco jumentos da raça Pêga, submetido a um protocolo de congelamento envolvendo um diluidor e duas formas de envase, flatpacks ou palhetas de 0,55mL, tendo como ponto final a avaliação dos parâmetros seminais in vitro após o descongelamento do sêmen. Os resultados de motilidade espermática para as amostras envasadas em flatpacks ou em palhetas foram de 24,67% e 35,34%, no momento do descongelamento; de 13,39% e 25,83%, 60 minutos após o descongelamento; e de 7,86% e 13,33%, aos 120 minutos após o descongelamento, respectivamente. Já os valores para o vigor espermático foram de 2,55 e 3,33, no momento do descongelamento; de 1,57 e 2,48, após 60 minutos do descongelamento; e de 1,11 e 1,67, após 120 minutos do descongelamento, na mesma ordem anterior. As características seminais diferiram entre os jumentos, evidenciando uma grande variação individual. O percentual de ejaculados aprovados (motilidade ≥30%, vigor ≥3) foi influenciado pelo reprodutor e pelo tipo de envasamento, estando o melhor resultado (P<0,05), de 86,21%, associado ao sêmen envasado em palhetas, quando comparado ao valor de 56,67%, obtido para o sêmen envasado em flatpacks.

The effect of the type of package on the cryopreservation of jackass semen was studied, using the sperm-rich fraction of five jackasses and a special cryopreservation semen protocol, related to one extender and two different packages, FlatPacks or straws. The characteristics of the in vitro semen were evaluated after thawing. The motility results were 24.67% and 35.34% after thawing; 13.39% and 25.83% 60 minutes after thawing and 7.86% and 13.33%, 120 minutes after thawing. The vigor results were 2.55 and 3.33 after thawing, 1.57 and 2.48 60 minutes after thawing and 1.11 and 1.67 120 minutes after thawing, for FlatPacks or straws packages, respectively. The jackasses used were different regarding seminal characteristics, with great individual variation. The approved post-thaw viability (motility ≥ 30%, vigor ≥ 3) was affected by jackass and type of package, with the best results (P<0.05) for semen packed in straws (86.21%), compared to semen packed in FlatPacks (56.67%).

Cryopreserved sperm for oocyte fertilization of dourado Salminus brasiliensis / Sêmen criopreservado na fertilização de ovócitos de dourado Salminus brasiliensis

Salminus brasiliensis is a migratory fish that has attracted considerable interest for aquaculture. Several procedures for induced spawning are known; however, there is a lack of protocol which enables the use of cryopreserved semen. Therefore, this study was conducted to investigate the use of cryopreserved semen using different volumes of cryopreserved semen relative to oocytes, different activators solutions and different maintenance time during the fertilization of dourado to evaluate the impact of these parameters on the fertilization rate. The semen was collected, cryopreserved in 0.5mL straws and stored in a dry shipper. Oocytes samples were fertilized according to each treatment. The different activator solutions and the contact times of the gametes with activators affected significantly the fertilization rates, which ranged between 13.4 and 27.8%, while fresh semen fertility rate was 80.8%. The relationship between oocyte and cryopreserved semen was significant, being the best ratio 0.05mL of cryopreserved semen per 10g of oocytes, while upper or lower volumes promoted a reduction in fertilization. The use of cryopreserved semen was effective to fertilize S. brasiliensis oocytes, however produced lower fertility rate than fresh semen.

O dourado, Salminus brasiliensis, é um peixe migrador que tem despertado interesse para piscicultura. Os procedimentos convencionais para a sua reprodução são conhecidos, contudo, falta um protocolo para o uso do sêmen criopreservado. Dessa forma, objetivou-se avaliar diferentes volumes de sêmen criopreservado, ouso de diferentes soluções ativadoras e com diferentes tempos de contato do sêmen com os ovócitos na taxa de fertilização. Para tal, o sêmen foi coletado e criopreservado em palhetas de 0,5mL em vapor de nitrogênio líquido. Amostras de ovócitos foram fertilizadas conforme os distintos tratamentos. As diferentes soluções testadas e o tempo de contato dos ativadores afetaram significativamente as taxas de fertilização, com valores que variaram entre 13,4 e 27,8%, enquanto o sêmen fresco propiciou 80,8% de taxa de fertilização. O volume de sêmen criopreservado afetou a taxa de fertilização dos ovos, sendo 0,05mL para 10g de ovócitos, o que promoveu os melhores resultados, sendo que volumes superiores e inferiores promoveram redução na fertilização. O uso de sêmen criopreservado foi efetivo na fertilização dos ovócitos de dourado, no entanto, foram obtidas taxas de fertilização inferiores àquelas observadas com o uso de sêmen fresco.