Improving the expression of recombinant pullulanase by increasing mRNA stability in Escherichia coli

Background: Pullulanase production in both wild-type strains and recombinantly engineered strains remains low. The Shine-Dalgarno (SD) sequence and stem-loop structure in the 5' or 3' untranslated region (UTR) are well-known determinants of mRNA stability. This study investigated the effect of mRNA stability on pullulanase heterologous expression. Results: We constructed four DNA fragments, pulA, SD-pulA, pulA-3t, and SD-pulA-3t, which were cloned into the expression vector pHT43 to generate four pullulanase expression plasmids. The DNA fragment pulA was the coding sequence (CDS) of pulA in Klebsiella variicola Z-13. SD-pulA was constructed by the addition of the 5' SD sequence at the 5' UTR of pulA. pulA-3t was constructed by the addition of a 3' stem-loop structure at the 3' UTR of pulA. SD-pulA-3t was constructed by the addition of the 5' SD sequence at the 5' UTR and a 3' stem-loop structure at the 3' UTR of pulA. The four vectors were transformed into Escherichia coli BL21(DE3). The pulA mRNA transcription of the transformant harboring pHT43-SD-pulA-3t was 338.6%, 34.9%, and 79.9% higher than that of the other three transformants, whereas the fermentation enzyme activities in culture broth and intracellularly were 107.0 and 584.1 times, 1.2 and 2.0 times, and 62.0 and 531.5 times the amount of the other three transformants (pulA, SD-pulA, and pulA-3 t), respectively. Conclusion: The addition of the 5' SD sequence at the 5' UTR and a 3' stem-loop structure at the 3' UTR of the pulA gene is an effective approach to increase pulA gene expression and fermentation enzyme activity.

Producción de etanol a partir de cebada no malteada hidrolizada con α y β amilasas comerciales / Ethanol production from hydrolyzed unmalted barley using commercial α- and β-amylase / Produção de etanol a partir de cevada não maltada hidrolisada com α e β amilases comerciais

Objetivo. Establecer la concentración óptima de α y β amilasas comerciales para la obtención de etanol a partir de cebada sin maltear. Materiales y métodos. Cebada no malteada fue hidrolizada con concentraciones variables de α y β amilasas comerciales (Genencor Internacional), bajo las condiciones establecidas por el fabricante. Los productos de hidrólisis fueron utilizados como sustrato para la producción de etanol con Sacharomyces cerevisiae. Adicionalmente se realizó un ensayo referencia con cebada malteada, bajo las condiciones establecidas por la destilería. Resultados. Se obtuvo un porcentaje de hidrólisis del almidón de 89,4% cuando se adicionaron de α y β amilasas a una concentración de 1gL-1, adicionalmente se obtuvo la máxima producción de etanol (5,02 %), siendo significativamente más alta que cuando se utilizó cebada malteada (3,76 %). Conclusiones. Se demostró que se puede producir etanol a partir de almidón de cebada sin maltear empleando α y β-amilasas comerciales, aunque es necesario optimizar el proceso ya que es más costoso comparado con el tradicional, utilizando cebada malteada.

Objective. To find the optimum concentration of commercial α- and β-amylase for the obtainment of ethanol from unmalted barley. Materials and methods. Unmalted barley was hydrolyzed using various concentrations of commercial α- and β-amylase (Genencor International), following conditions established by the manufacturer. The products of hydrolysis were used as substrates for the production of ethanol by Saccharomyces cerevisiae. In addition, a reference assay was performed using malted barley following the conditions established by the distillery. Results. The percentage of starch hydrolysis was 89.4% when adding α-and β-amylase at a concentration of 1 g L-1. Moreover, this concentration of amylases yielded a maximum ethanol production (5.02 %) significantly higher than when malted barley was used (3.76 %). Conclusions. It was demonstrated that ethanol can be obtained from starch of unmalted barley by adding commercial α- and β-amylase. However, optimization of the process is required due to the higher costs when compared to the traditional process with malted barley.

Objetivo. Estabelecer a concentração ideal de α e β amilases comerciais para a obtenção de etanol a partir de cevada não malteada. Materiais e métodos. Cevada não malteada foi hidrolisada com diferentes concentrações de α e β amilases comerciais (Genencor Internacional), sob as condições estabelecidas pelo fabricante. Os produtos da hidrólise foram utilizados como substrato para produção de etanol com Saccharomyces cerevisiae. Além disso, se realizou um teste de referência com cevada malteada, sob as condições estabelecidas pela destilaria. Resultados. Se obtive uma percentagem de hidrólise do amido de 89,4% ao adicionar á e â amilases na concentração de 1gL-1, adicionalmente se obtive a produção máxima de etanol (5,02%), sendo significativamente maior do que quando é usada cevada malteada (3,76%). Conclusões. Foi demonstrado que o etanol pode ser produzido a partir de amido de cevada não maltada com α e β-amilases comerciais, embora seja necessário aperfeiçoar o processo, porque é mais caro, em comparação com o tradicional, utilizando cevada maltada.

Mycelial glucoamylases produced by the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum strains 15.1 and 15.8: purification and biochemical characterization / Glucoamilases miceliais produzidas pelas linhagens 15.1 e 15.8 do fungo termofílico Scytalidium thermophilum: purificação e caracterização bioquímica

Two strains (15.1 and 15.8) of the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum produced high levels of intracellular glucoamylases, with potential for industrial applications. The isoform I of the glucoamylase produced by 15.1 strain was sequentially submitted to DEAE-Cellulose and CM-Cellulose chromatography, and purified 141-fold, with 5.45 percent recovery. The glucoamylase of strain 15.8 was purified 71-fold by CM-Cellulose and Concanavalin A-Sepharose chromatography, with 7.38 percent recovery. Temperature and pH optima were in the range of 50-60ºC and 5.0-6.0, respectively, using starch and maltose as substrates. The glucoamylase of S. thermophilum 15.8 was more stable (t50 > 60 min) than that of S. thermophilum 15.1 (t50= 11-15 min), at 60ºC. The glucoamylase activities were enhanced by several ions (e.g. Mn2+ and Ca2+) and inhibited by β-mercaptoethanol. The glucoamylase from 15.1 strain showed a Km of 0.094 mg/ml and 0.029 mg/ml and Vmax of 202 U/mg prot and 109 U/mg prot, for starch and maltose, respectively. The hydrolysis products of starch and maltose, analyzed by TLC, demonstrated glucose as end product and confirming the character of the enzyme as glucoamylase. Differences were observed in relation to the products formed with maltose as substrate between the two strains studied. S. thermophilum 15.8 formed maltotriose in contrast with S. thermophilum 15.1.

Duas linhagens (15.1 e 15.8) do fungo termofílico Scytalidium thermophilum se mostraram produtoras de grandes quantidades de glucoamilases, com potencial aplicação industrial. A isoforma I de glucoamilase produzida pela linhagem 15.1 foi submetida seqüencialmente a cromatografia em colunas de DEAE-celulose e CM-celulose, sendo purificada 141 vezes com porcentagem de recuperação de 5,45 por cento. A glucoamilase da linhagem 15.8 foi purificada 71 vezes através do uso de colunas de cromatografia de CM-celulose e Concanavalina A-sepharose com porcentagem de recuperação de 7,38 por cento. Temperatura e pH ótimo foram de 50-60ºC e 5,0-6,0 respectivamente, utilizando-se amido e maltose como substratos. A glucoamilase de S. thermophilum 15.8 se mostrou mais estável (t50 > 60 min) que a de S. thermophilum 15.1 (t50 =11-15min) a 60ºC. As glucoamilases tiveram suas atividades enzimáticas aumentadas na presença de vários íons (ex: Mn2+, e Ca2+) e inibidas por β-mercaptoetanol. A glucoamilase da linhagem 15.1 apresentou um Km de 0,094 mg/ml e 0,029 mg/ml and Vmax de 202U/mg prot e 109U/mg prot, para amido e maltose respectivamente. A análise do produto da hidrólise de amido e maltose por TLC, demonstrou que o produto final era glucose, confirmando as características da enzima como glucoamilase. Diferenças entre as duas linhagens foram observadas com relação aos produtos formados tendo maltose como susbstrato, a linhagem 15.8 de S. thermophilum produziu maltotriose como produto final em contrate com a linhagem 15.1.