RESUMO
Abstract Background: Oocyte quality and maturation are influenced by protein supplementation. Objective: To evaluate the influence of fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) concentrations on the recovery and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. Methods: The study was divided into Stage 1 (oocyte recovery), and Stage 2 (IVM). In the first stage, three experiments were conducted according to the recovery (R) medium used: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; and (R3) the best results from R1, R2, and the combination of FBS+BSA (5+5%). Within the second stage, the maturation medium was supplemented according to three experiments: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0.4 vs. 0.8% BSA; and (M3) better results of M1, M2, and the combination of FBS+BSA (5+0.8%). Results: In Stage 1 (R1 and R2), the media with 10% FBS and 10% BSA showed better oocyte quality results and were defined for experiment R3. In R3, the 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) allowed recovery of better-quality oocytes. In Stage 2 (M1 and M2), media with both levels of FBS (5 and 10%) and 0.8% BSA were defined as better according to the maturation and viability rates of cumulus cells, so they were defined for experiment M3. In M3, no difference was noted among the supplements. Conclusions: For oocyte recovery, 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) can be used to obtain immature oocytes. For the in vitro maturation, FBS (both levels, 5 and 10%) and BSA (0.8%) can be used alone or in combination.
Resumen Antecedentes: La calidad y maduración de los ovocitos son influenciados por la suplementación proteica. Objetivo: Evaluar la influencia de concentraciones de suero fetal bovino (FBS) y albúmina sérica bovina (BSA) en la recuperación y maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos. Métodos: El estudio se dividió en Etapa 1 (recuperación de ovocitos) y Etapa 2 (IVM). En la primera etapa, tres experimentos se realizaron de acuerdo con el medio de recuperación: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; y (R3) los mejores resultados de R1, R2 y la combinación de FBS+BSA (5+5%). En la segunda etapa, el medio de maduración fue suplementado para tres experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; y (M3) mejores resultados de M1, M2 y la combinación de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: En la Etapa 1 (R1 y R2), los medios con 10% FBS y 10% BSA mostraron mejores resultados de calidad oocitaria y fueron definidos para el experimento R3. En R3, 10% FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) permitieron la recuperación de ovocitos de mejor calidad. En la Etapa 2 (M1 y M2), los medios con ambos niveles de FBS (5 y 10%) y 0,8% de BSA se definieron como mejores de acuerdo con las tasas de maduración y viabilidad de las células del cumulus, por lo que se definieron para el experimento M3. En M3, no se observó diferencia entre los suplementos. Conclusiones: Para la recuperación de ovocitos, se puede utilizar 10% de FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) para obtener ovocitos inmaduros. Para la maduración in vitro, FBS (ambos niveles, 5 y 10%) y BSA (0,8%) se pueden usar solos o en combinación.
Resumo Antecedentes: A qualidade e a maturação de oócitos são influenciadas pela suplementação proteica. Objetivo: Avaliar a influência de concentrações de soro fetal bovino (FBS) e albumina sérica bovina (BSA) sobre a recuperação e maturação in vitro (IVM) de oócitos bovinos. Métodos: O estudo foi dividido em Etapa 1 (recuperação de oócitos) e Etapa 2 (IVM). Na primeira etapa, três experimentos foram realizados de acordo com o meio de recuperação: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; e (R3) melhores resultados de R1, R2 e a combinação de FBS+BSA (5+5%). Na segunda etapa, o meio de maturação foi suplementado de acordo com três experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; e (M3) melhores resultados de M1, M2 e a combinação de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: Na Etapa 1 (R1 e R2), os meios com 10% FBS e 10% BSA mostraram melhores resultados de qualidade oocitária e foram definidos para o experimento R3. Em R3, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) permitiram a recuperação de oócitos de melhor qualidade. Na segunda etapa (M1 e M2), meios com ambos os níveis de FBS (5 e 10%) e 0,8% BSA foram definidos como os melhores de acordo com as taxas de maturação e viabilidade de células do cumulus, então foram definidos para o experimento M3. No M3, não houve diferença entre os suplementos. Conclusões: Para a recuperação oocitária, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) podem ser usados para obter oócitos imaturos. Para maturação in vitro, FBS (ambos os níveis, 5 e 10%) e BSA (0,8%) podem ser usados sozinhos ou em combinação.
RESUMO
Las células madre estromales humanas y de roedores cultivadas pueden ser inducidas a diferenciarse en neuronas, enfatizando su utilidad potencial en la terapia celular neurorrestaurativa. Los sistemas de cultivo para la expansión de estas células describen el uso de diferentes proporciones de suero fetal, lo que motivó a estudiar qué concentración de suero fetal bovino era capaz de garantizar un adecuado rendimiento celular. Las células de la médula ósea de rata se cultivaron en medio a-MEM suplementado con 10 y 20 por cientode suero fetal bovino y se subcultivaron hasta 3 veces. La viabilidad celular de los cultivos primarios y los subcultivos estuvo por encima del 98 por ciento en ambos experimentos. Los cultivos primarios demoraron 17,4 días en confluir y los subcultivos 7,7 días. La concentración de suero fetal al 20 por ciento no aumentó significativamente la velocidad de multiplicación celular; no obstante, se obtuvo un mayor número de células estromales. El sistema de expansión in vitro podría utilizarse en estudios futuros para la expansión de las células estromales humanas, lo que sienta mejores bases para su aplicación clínica
Cultured human and rodents stromal stem cells can be induced to differentiate into neurons, emphasizing its potential use in neurorestorative cell therapy. Cropping systems for the expansion of these cells describe the use of different ratios of fetal serum, which led to study what concentration of fetal calf serum was able to ensure an adequate cell yield. Cells from rat bone marrow were cultured in medium supplemented with a-MEM 10 and 20 percent fetal bovine serum and subcultured up to 3 times. Cell viability of primary cultures and subcultures was above 98 percent in both experiments. Primary cultures converge delayed in 17.4 days and 7.7 days subcultures. The concentration of 20 percent fetal calf serum did not significantly increase the speed of cell division, however, we obtained a greater number of stromal cells. The expansion in vitro system could be used in future studies for the expansion of human stromal cells, which feels better basis for clinical application
Assuntos
Células Estromais/transplante , Dispositivos para Expansão de Tecidos/normas , Ratos/genética , Soro/imunologia , Técnicas de Cultura/métodosRESUMO
En este trabajo se presentan los resultados de las pruebas biológicas realizadas para evaluar la funcionalidad y desempeño del suero fetal bovino de fabricación nacional sobre el crecimiento de cultivos celulares con diversos requerimientos nutricionales. Realizando ensayos de eficiencia de clonaje, eficiencia de plaqueo y curvas de crecimiento sobre líneas celulares y fibroblastos, se demostró que el suero de fabricación nacional puede ser empleado en el cultivo continuo de las líneas A549, PC-3, HT-29, MDA-MB231 con un buen desempeño; y en fibroblastos, las células LSPG8G, MDBK e hibridomas puede ser usado siempre y cuando se emplee al 10% y se realicen cambios de medio al menos cada 48 horas. En ninguno de los ensayos se observó un efecto tóxico o adverso sobre el crecimiento de las células empleadas, aunque en algunos casos se observó una menor funcionalidad frente al crecimiento celular comparando los resultados con otros sueros calificados. Los resultados obtenidos destacan la utilidad del SFB nacional en la aplicación para la propagación de células poco exigentes en ensayos de corta duración, así como en procedimientos transitorios tales como la inactivación de la actividad enzimática de la tripsina y criopreservación.
In this work, we present the results of biological tests performed to evaluate the functionality and performance of fetal bovine serum produced in Colombia, on the growth of cell cultures with different nutritional requirements. Performing cloning efficiency tests, plating efficiency and growth curves of cell lines and fibroblasts, showed that the Colombian serum can be used with a good performance, in continuous culture of cell lines A549, PC-3, HT-29, MDA-MB231, in fibroblasts LSPG8G cells, MDBK and hybridomes can be used in a minimum concentration of 10% and medium every 48 hours. It should be noted that none of the treatments showed a toxic or adverse effect on the growth of the cells used, although in some cases had less functionality compared to cell growth by comparing the results with other qualified serum. Therefore, the Colombian showed to be suitable for the propagation of short-term culture cells, as well as transitional procedures such as trypsin inactivation, and cryopreservation.
RESUMO
Objective: real time PCR analysis for the detection of seven bovine pathogenic viruses: Bovine Adenovirus (BAdV), Bovine Viral Diarrhea Virus Types 1 and 2 (BVDV-1 and BVDV-2), Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV), Vesicular Stomatitis Virus (VSV), Bovine Parainfluenza Virus 3 (BPIV-3), Bovine Herpes Virus-1 (BoHV-1), and Mycoplasma was conducted using fetal bovine serum (FBS, MICROGEN®) obtained in Colombia, aiming to include it as part of the serum quality control. Methods: bovine derived MDBK and human derived HEp-2 cell lines were cultured with the test serum for 21 days, collecting supernatant and cellular samples every 7-days. Once DNA and RNA were extracted, the later was converted into cDNA and both samples were subjected to real time PCR using specific primers and Resolight® (DNA-binding fluorescent dye). Standard curves were generated using serial dilutions of cloned specific viral sequences. Accurate amplification and high efficiency was demonstrated in these reactions. Results: realtime PCR amplification did not show a persistent increase of viral counts in cultures during the 21-day follow-up. However, for vesicular stomatitis virus, a transient increase was observed at 7 and 14 days in both cell lines, but considered as not conclusive for viral presence. Conclusions: real time PCR analysis showed to be a suitable method for viral detection in fetal bovine serum samples and through this method no consistent viral or mycoplasma presence was detected in the MICROGEN® fetal bovine serum.
Objetivos: se empleó el método de PCR en tiempo real para detectar los virus patógenos bovinos: Adenovirus bovino (BAdV), virus de la diarrea Viral Bovina tipos 1 y 2 (BVDV-1 y BVDV-2), Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV), Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), Virus de la Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV-3), Herpesvirus Bovino-1 (BoHV-1) y Mycoplasma, en suero fetal bovino (FBS, MICROGEN ®)obtenido en Colombia, con el objetivo de incluir estos análisis en el control de calidad del FBS. Metodos: las líneas celulares MDBK de origen bovino y HEp-2 de origen humano se cultivaron con el FBS MICROGEN® por 21 días, tomando muestras de cultivos y sobrenadantes cada 7 días. Una ves extraido el DNA y RNA, a partir de este último se sintetizó cDNA, y en los dos tipos de muestras se analizó la presencia de los agentes patógenos mencionados por PCR en tiempo real empleando iniciadores específicos para cada uno y Resolight® (colorante fluorescente de unión a DNA). Se generaron curvas estándar con diluciones seriadas de secuencias virales específicas clonadas en plásmidos, que mostraron amplificación específica y altas eficiencias. Resultados: el análisis de los cultivos mantenidos con el FBS en estudio no mostró aumento del número de copias virales detectadas a lo largo del periodo de 21 días de seguimiento, excepto para el virus de la estomatitis vesicular, que mostró un incremento transitorio en los sobrenadantes de los cultivos de las dos líneas celulares a los 7 y 14 días de cultivo, que no se consideró concluyente para la presencia del virus. Conclusiones: el método de PCR en tiempo real mostró utilidad para la detección de virus patógenos y mycoplasma en FBS, y mediante este método no se obtuvieron resultados que permitan concluir que los patógenos virales o los mycoplasmas están presentes en los cultivos mantenidos con el suero fetal bovino MICROGEN®.
Objetivo: Foi utilizado o método de PCR em tempo real para detectar os vírus patogénicos bovinos: Adenovírus Bovino (BAdV), Vírus da Diarreia Viral (BVDV-1 e BVDV-2), Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV ), Vírus da Estomatite Vesicular (VSV), Vírus da Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV- 3), Herpesvírus Bovino-1 (BoHV-1) e Mycoplasma, em soro fetal bovino (FBS, Microgen®) obtido na Colômbia, de modo a incluir esta análise no controle de qualidade FBS. Métodos: as linhas celulares de MDBK de origem bovina e HEp-2 de origem humana foram cultivadas com FBS Microgen® durante 21 dias, tomando amostras de cultura e sobrenadantes cada 7 dias. Uma vez retirado o DNA e RNA, foi sintetizado o cDNA a partir do RNA. Nos dois tipos de amostras foram analisadas para determinar a presença de patógenos mencionados por PCR em tempo real usando primers específicos para cada um e Resolight®(corante fluorescente de união à DNA). As curvas padrão foram geradas com diluições em série de sequências virais específicas, clonadas em Resultados: plasmídeos, que mostram amplificação específica e altas eficiências. a análise das culturas mantidas em FBS em estudo, não mostraram aumento no número de cópias virais detectadas ao longo do período de 21 dias de seguimento, exceto para o vírus da estomatite vesicular, que mostrou um aumento transitório nos sobrenadantes das culturas de duas linhas celulares aos 7 e 14 dias de cultura, que não foi considerado conclusivo para a presença do vírus. Conclusões: O método de PCR em tempo real foi útil para a detecção de vírus patogênicos e mycoplasma em FBS, e por este método foram obtidos resultados que demonstram que patógenos virais ou mycoplasmas estão presentes nas culturas mantidas com soro fetal bovino Microgen®.