Efeitos do consumo agudo e crônico de etanol sobre as funções mitocondriais: estudos em ratos Wistar (Rattus novergicus) / Effects of short and long-term ethanol consumption on mitochondrial functions: studies in Wistar rats (Rattus novergicus)

O número de indivíduos que sofrem com patologias associadas ao consumo abusivo de etanol tem aumentado significativamente no último século. Como consequência desse fato, os custos associados ao tratamento do alcoolismo, bem como das doenças associadas a ele também têm aumentado, onerando o sistema de saúde e se tornando um problema de saúde pública de grande relevância atualmente. Os mecanismos moleculares que desencadeiam muitas dessas doenças não estão completamente esclarecidos. O tecido hepático é o mais afetado pelo etanol e as mitocôndrias têm sido apontadas como alvos cruciais na toxicidade hepática induzida pelo álcool. Logo, o objetivo desse trabalho foi investigar como o consumo de etanol afeta o estado redox e o metabolismo mitocondriais no fígado. Ratos Wistar machos adultos jovens e de meia-idade receberam ad libitum solução alcoólica 25% (v/v) como única fonte de líquido. Os grupos controle receberam somente água. Ambos os grupos receberam ração ad libitum. Mitocôndrias hepáticas foram isoladas usando técnicas padrão. O consumo de ração e de líquidos foi significativamente menor em animais que ingeriram álcool, resultando em menor ganho de massa corpórea nos protocolos utilizados. As mitocôndrias dos animais que consumiram etanol apresentaram menores níveis de respiração em condição basal e quando energizadas com substratos respiratórios. A atividade e os níveis protéicos de citocromo c oxidase foi menor nos grupos tratados com etanol. Independente da duração do período de tratamento, mitocôndrias hepáticas de animais que ingeriram álcool foram menos susceptíveis à transição de permeabilidade mitocondrial induzida por cálcio, quando comparadas às mitocôndrias dos animais do grupo controle...

The number of people suffering from alcoholism has increased significantly over the last century. As a result, costs associated with treating the addiction itself as well as the associated pathologies have also increased, such that this is considered as public health issue. Furthermore, the molecular events leading to several of these diseases are not yet clearly understood. Hepatic tissue is the most affected by alcohol, and mitochondria have been suggested to be a crucial target in alcohol-induced liver toxicity. Thus, the aim of our study was to investigate how ethanol consumption affects the redox state and mitochondrial metabolism in the liver. Young adult and middle-aged male Wistar rats were given a 25 % (v/v) ethanol solution as the only source of drinking water. Control groups received water only. Liver mitochondria were isolated using standard techniques. Food and water intake was significantly lower in alcohol-drinking rats, resulting in lower weight gain during the treatment regimes. Mitochondria from the alcohol-drinking group had lower respiration under levels in basal condition, when energized by substrates feeding electrons into complexes I and IV. Cytochrome c oxidase activity and protein levels were lower in the alcohol group as well. Additionally, regardless of the length of the treatment, liver mitochondria from the alcohol-treated animals were more resistant to Ca2+-induced mitochondrial permeability transition (MPT), when compared to mitochondria from control animals. This effect was abrogated by oxidizing agents of pyridine nucleotides (acetoacetate, diamide or tert butylhydroperoxide) or in uncoupled mitochondria. We also found that liver mitochondria from the alcohol-drinking rats had a more reduced pyridine nucleotide pool and higher NAD(P)H/NAD(P)+ ratios. In addition, Nampt (an enzyme of the NAD+ synthetic pathway) protein levels did not differ after alcohol consumption. ..

Inibição da transição de permeabilidade mitocondrial por cPTIO, um sequestrador de óxido nítrico / Inhibition of mitochondrial permeability transition by cPTIO, a nitric oxide scavenger

Além de essencial na respiração celular, a mitocôndria é considerada uma organela de papel fundamental em processos de sinalização e morte celular. A geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de espécies reativas de nitrogênio (ERNs) pela mitocôndria podem ser consequência destes processos de sinalização tanto em condições fisiológicas quanto em patologias, tais como a dislipidemia e câncer. A transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) é um tipo de permeabilização não-seletiva da membrana mitocôndrial interna que permite a passagem de moléculas de até 1,5 KDa, causando dissipação do potencial eletroquímico de H+ e inchamento da organela. O termo transição é usado porque a permeabilização pode ser parcialmente revertida, logo após o inicio do processo, pela adição de quelantes de Ca2+ como o EGTA, por exemplo, ou redutores tiólicos. A oxidação de grupamentos tiólicos promove a TPM. Os experimentos apresentados nesta tese indicam o composto 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO) caracteriza-se como um inibidor da TPM. As pequenas alterações observadas em relação à respiração e fosforilação oxidativa não se correlacionam com a abertura do PTP, pelo menos com base na literatura corrente. Em outras palavras, a presença de cPTIO diminuiu os níveis de NOo mitocondrial e desviou a reação deste composto com o ânion superóxido diminuindo a produção de peroxinitrito, provável indutor de abertura do PTP nestas condições experimentais.

In addition to be the site of cellular respiration, the mitochondrion has important role in cell signaling for cell physiology and death. The generation of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) by the mitochondrion can participate in cellular signaling both in physiological and pathological conditions, such as dyslipidemia and cancer. The Mitochondrial Permeability Transition (MPT) is a non-selective inner membrane permeabilization that enables free passage of molecules up to 1.5 kDa, dissipating the H+ electrochemical gradient and the organelle's swelling. The term transition is applied because the permeabilization can be partially reverted, right after the beginning of the process, by chelating extramitochondrial Ca2+ with EGTA, for example, or by using thiol reducers. The oxidation of membrane protein thiols leads to MPT. The experiments shown in this thesis indicate that the compound 2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-l-oxyl-3-oxide (cPTIO) has proven to be a strong inhibitor agent of the MPT. The small changes observed in relation to respiration and oxidative phosphorylation did not correlate with the opening of PTP, at least on the basis of the current literature. In other words, the presence of cPTIO decreased levels of NOo and mitochondrial diverted reaction of this compound with superoxide anion decreasing production of peroxynitrite, likely inducing PTP opening under these experimental conditions.

High susceptibility of activated lymphocytes to oxidative stress-induced cell death

The present study provides evidence that activated spleen lymphocytes from Walker 256 tumor bearing rats are more susceptible than controls to tert-butyl hydroperoxide (t-BOOH)-induced necrotic cell death in vitro. The iron chelator and antioxidant deferoxamine, the intracellular Ca2+ chelator BAPTA, the L-type Ca2+ channel antagonist nifedipine or the mitochondrial permeability transition inhibitor cyclosporin A, but not the calcineurin inhibitor FK-506, render control and activated lymphocytes equally resistant to the toxic effects of t-BOOH. Incubation of activated lymphocytes in the presence of t-BOOH resulted in a cyclosporin A-sensitive decrease in mitochondrial membrane potential. These results indicate that the higher cytosolic Ca2+ level in activated lymphocytes increases their susceptibility to oxidative stress-induced cell death in a mechanism involving the participation of mitochondrial permeability transition.

O presente estudo demonstra que linfócitos ativados de baço de ratos portadores do tumor de Walker 256 são mais susceptíveis à morte celular necrótica induzida por tert-butil hidroperóxido (t-BOOH) in vitro quando comparados aos controles. O quelante de ferro e antioxidante deferoxamina, o quelante intracelular de Ca2+ BAPTA, o antagonista de canal de Ca2+ nifedipina ou o inibidor da transição de permeabilidade mitocondrial ciclosporina-A, mas não o inibidor de calcineurina FK-506, inibiram de maneira similar a morte celular induzida por t-BOOH em linfócitos ativados e controles. Os linfócitos ativados apresentaram redução do potencial de membrana mitocondrial induzida por t-BOOH num mecanismo sensível a ciclosporina-A. Nossos resultados indicam que o aumento da concentração de Ca2+ citosólico em linfócitos ativados aumenta a susceptibilidade dos mesmos à morte celular induzida por estresse oxidativo, num mecanismo envolvendo a participação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial.