RESUMO
A vacinação é a forma mais utilizada para prevenir a bronquite infecciosa causada pelo vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV). Contudo, as vacinas convencionais são incapazes de diferenciar aves infectadas de vacinadas. No presente trabalho foi construído, caracterizado, e avaliado como candidato vacinal, um adenovírus recombinante expressando o gene N do IBV. O gene N foi clonado em um adenovírus humano tipo 5 defectivo e transfectado para as células HEK-293A para gerar rAd5_N. Após o vetor ser obtido como esperado e a confirmação da expressão da proteína N em HEK-293ª, foi realizada inoculação pela via oculo-nasal na dose de 10 7 TCID 50 /0,1mL para imunização de galinhas livres de patógenos específicos (SPF). A resposta imunológica do Ad5_N e a proteção contra o desafio ao IBV foram avaliadas e comparadas com uma vacina viva comercial. Não foram detectados anticorpos anti-IBV em aves vacinadas com o Ad5_N. A vacina comercial induziu anticorpos detectáveis a partir do 7º dia pós-vacinal. Em aves vacinadas com o Ad5_N não houve aumento na expressão de IFNγ. Neste estudo, o rAd5_N obtido não conferiu proteção contra desafio com IBV-M41. Os resultados indicam a necessidade de avaliar adenovírus recombinantes expressando outros genes do IBV.(AU)
Assuntos
Animais , Vacinas Sintéticas , Galinhas , Infecções por Coronavirus/prevenção & controle , Vírus da Bronquite Infecciosa , Nucleoproteínas , Proteínas do NucleocapsídeoRESUMO
O vírus da bronquite infecciosa (IBV) é um importante patógeno respiratório presente na avicultura comercial e tem provocado grandes perdas econômicas em todo o mundo. A vacinação é realizada pela indústria produtora de aves, mas continuam surgindo novos sorotipos e variações antigênicas, dificultando o controle de IBV. Nós realizamos uma caracterização molecular de uma cepa de IBV obtida diretamente de tecidos e comparamos com a mesma cepa que havia sido passada três vezes em ovo embrionado. Nós mostramos uma variação significante na sequência viral depois de ter sido isolada em ovo embrionado.(AU)
Assuntos
Vírus da Bronquite Infecciosa/isolamento & purificação , Estabilidade de RNA/genética , VacinaçãoRESUMO
A Brazilian field isolate (IBV/Brazil/PR05) of avian infectious bronchitis virus (IBV), associated with development of nephritis in chickens, was previously genotyped as IBV variant after S1 gene sequencing. The aim of this study was to evaluate the levels of IL-6 in kidneys and trachea of birds vaccinated and challenged with IBV/Brazil/PR05 strain, correlating these results with scores of microscopic lesions, specific IBV antigen detection and viral load. The up-regulation of IL-6 and the increased levels of viral load on renal and tracheal samples were significantly correlated with scores of microscopic lesions. Reduced levels of viral load were detected in kidneys of birds previously vaccinated and challenged, compared to non-vaccinated challenged group, although markedly microscopic lesions were observed for both groups. The expression of IL-6, present both in the kidney and in the tracheas, was dependent on the load of the virus present in the tissue, and the development of lesions was related with IL-6 present in the tissues. These data suggest that variant IBV/Brazil/PR05 can induce the expression of proinflammatory cytokines in a manner correlated with viral load and increased IL-6 is involved in the tissue with the influx of inflammatory cells and subsequent nephritis. This may contribute with a model to the development of immunosuppressive agents of IL-6 to prevent acute inflammatory processes against infection with IBV and perhaps other coronaviruses, as well as contribute to the understanding of the immunopathogenesis of IBV nephropatogenic strains.
Uma estirpe variante do vírus da bronquite infecciosa (VBI) associada com o desenvolvimento de nefrite em galinhas, foi isolado e identificado como variante por análise do gene S1. A estirpe IBV/Brazil/PR05 foi testada quanto à sua capacidade de induzir a expressão de interleucina-6 (IL-6) nos tecidos renais e traqueais. Galinhas vacinadas com a estirpe Massachusetts H120 e não vacinadas foram desafiadas com a estirpe IBV/Brazil/PR05. Cinco dias após a infecção, traquéias e rins foram coletados para análise por RT-qPCR, imunohistoquímica e histopatologia. Foi determinada a expressão relativa de IL-6 e da carga viral. A expressão de IL-6 e carga viral foram correlacionadas com o desenvolvimento de nefrite e lesão traqueal. A expressão de IL-6 foi maior quando houve aumento da carga viral na traqueia e nos rins. A carga viral presente nos rins foi inferior quando as aves foram vacinadas, entretanto foi observada nefrite acentuada. Houve alta correlação entre o desenvolvimento de nefrite e o nível de expressão de IL-6, bem como a expressão de IL-6 e a carga viral. A expressão de IL-6, presente tanto nos rins e nas traqueias, foi relacionada a carga viral presente nestes tecidos, e o desenvolvimento das lesões foi relacionado com a expressão de IL-6. Estes dados sugerem que a variante IBV/Brazil/PR05 pode induzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias de forma correlacionada com a carga viral, e o aumento de IL-6 está envolvido com o influxo de células inflamatórias no tecido, o que evolui para o desenvolvimento de nefrite. Isto pode contribuir como um modelo para o desenvolvimento de agentes imunossupressores da IL-6 para evitar processos inflamatórios agudos contra infecção com o VBI e talvez outros coronavírus, bem como contribuir para o entendimento da imunopatogênese das estirpes nefropatogênicas deste vírus.
Assuntos
Animais , Galinhas/virologia , /isolamento & purificação , Nefrite/veterinária , Vírus da Bronquite Infecciosa/isolamento & purificação , Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real/veterinária , Rim/patologia , Traqueia/patologiaRESUMO
Anticorpos monoclonais constituem a base de vários testes usados na detecção e na identificação de antígenos. Nesse contexto, tais imuno-reagentes têm sido extensivamente empregados na identificação de estirpes virais envolvidas na etiologia de surtos de bronquite infecciosa a campo, permitindo o aperfeiçoamento das técnicas de detecção e caracterização antigênica do vírus da bronquite infecciosa das galinhas (VBI). No presente estudo, uma biblioteca de fragmentos de anticorpos de galinha originalmente preparada por phage display contra a estirpe vacinal (H120) do VBI foi usada para a seleção de fragmentos de anticorpos recombinantes com reatividade cruzada para as estirpes heterólogas IBVPR01 e IBVPR05, isoladas de surtos a campo no Brasil e a estirpe SE-17, isolada nos Estados Unidos. Após três ciclos de panning, foi identificado, pelo ELISA, um conjunto de 15 anticorpos scFv expressos em fagos e com reatividade cruzada para essas mesmas estirpes do VBI. A análise por Western-blotting revelou que dois desses clones apresentavam fagos expressando fragmentos de anticorpos monoclonais com reatividade cruzada para a nucleoproteína N das três estirpes do VBI e também para a forma recombinante dessa nucleoproteína derivada da estirpe M41. Concluindo, os fragmentos de anticorpos monoclonais recombinantes scFv-N produzidos em fagos interagem com um epítopo mais conservado da proteína N do VBI e apresentam um grande potencial para utilização na detecção e no diagnóstico direto desse vírus.
Monoclonal antibodies are the basis of various techniques used for antigen detection or characterization, and their use is specially recommended for the identification of viral strains involved in the etiology of infectious bronchitis outbreaks. These antibodies are homogeneous, highly specific and fully characterizable, allowing the improvement of immunological techniques detection and antigenic characterization of avian infectious bronchitis virus strains (IBV). A phage display library was used, which was prepared previously against the IBV vaccine strain (H120) for the selection of new scFv antibody fragments specific for heterologous IBV strains isolated from outbreaks in Brazil (IBVPR01, IBVPR05) and USA (SE-17). After three cycles of panning, a set of 15 scFv antibodies were expressed in phages and cross-reacted in ELISA with these three viral strains. Western-blotting analysis showed that two of the clones were expressing scFv specific for the nucleoprotein of these IBV strains, as well as to the recombinant form of this protein derived from M41. In conclusion, the recombinant fragments of monoclonal antibodies expressed in phage have a great potential for future use in immunodiagnostic techniques and to study the evolution of infectious bronchitis virus.
RESUMO
O gene da proteína de nucleocapsídeo (1.230 pb) da estirpe M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI) foi amplificado pelas reações de transcrição reversa e em cadeia da polimerase (RT-PCR) e clonado, em seguida, em dois sistemas; pET28a - Escherichia coli e pFLD -Pichia pastoris. Os produtos recombinantes construídos para expressão (pET28a-N ou pFLD-N) foram identificados por análises de PCR e de sequenciamento de nucleotídeos. Os clones transformantes da linhagem BL21 de E. coli e da linhagem GS115 de P. pastoris foram submetidos aos protocolos apropriados de indução. A expressão da proteína N de fusão com etiqueta de poli-histidina e com massa molecular de 54 kDa foi determinada pelas técnicas de SDS-PAGE e de Western blotting, confirmando-se que ambas proteínas N recombinantes apresentaram tamanhos e antigenicidade compatíveis com a proteína N nativa do próprio VBI. O sistema E. coli expressou uma quantidade relevante da proteína N recombinante, enquanto que o sistema P. pastoris produziu uma baixa recuperação dessa proteína recombinante. A proteína N recombinante gerada pelo sistema bacteriano foi purificada em resina de níquel-sepharose. O conjunto de resultados indica que o sistema de expressão constituído por pET28a E. coli é mais efetivo para produzir a proteína N recombinante do VBI destinada ao uso como antígeno para detectar anticorpos anti-virais específicos em ensaios de imunodiagnóstico para essa infecção viral.
The nucleocapsid protein (N) gene (1,230 bp) of the M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), and cloned in two systems; pET28a Escherichia coli and pFLD Pichia pastoris. The recombinant expression constructs (pET28a-N or pFLD-N) were identified by PCR and sequencing analysis. The transformant clones of BL21 strain of E. coli or GS115 of P. pastoris were submitted to appropriate inducting protocols. Expression of histidine-tagged fusion N proteins with a molecular mass of 54 kDa was determined by SDS-PAGE and Western blotting analysis, confirming that both recombinant N proteins were comparable in size and antigenicity to native IBV N protein. The E. coli system overexpressed the recombinant N protein, while the P. pastoris system produced a low yield of this recombinant protein. The bacteria expressed N protein was purified by chromatography on nickel-sepharose resin. These results indicated that the pET28a E. coli expression system is more effective to generate N recombinant protein for using as an antigen to detect anti-IBV antibodies in immuno-assays for this viral infection.