Simultaneous determination of sulfamethoxazole, trimethoprim and bromhexine in veterinary formulation using high performance liquid chromatography (HPLC)

Objetivo: desarrollar y validar un método simple, sensible y rápido para la determinación simultánea de sulfametoxazol (SMT), trimetoprima (TMP) y bromhexina (BMX) en formulación veterinaria por cromatografía líquida de alta resolución de acuerdo con las directrices de validación y control. Guía para la calidad analítica de medicamentos en productos alimenticios y medicamentos veterinarios, RDC 166/2017 y guías internacionales Conferencia Internacional sobre Armonización y Asociación Internacional de Químicos Analíticos Oficiales. Materiales y métodos: la separación se realizó en una columna analítica ThermoScientific® C18 AcclaimTM120 (4,6 x 250 mm, 5 µm), con caudal de 0,7 mL min-1 y detección a 245 nm, 265 nm y 271 nm, para BMX, SMT y TMP, respectivamente. Todas las mediciones se realizaron en metanol:agua (84:16 v/v; pH 3,0). Las curvas analíticas fueron lineales (r > 0,9997) en el rango de concentración de 15.0 a 30.0 µg-mL-1 para SMT, 3.0 a 9.0 µg-mL-1 para TMP y 0,5 a 2,0 µg-mL-1 para BMX. Resultados: el método demostró ser preciso con coeficientes de variación por debajo del límite máximo de 2,0%, robusto, sin influencia significativa de las variaciones utilizadas en el análisis, exacto (recuperación >99%) y selectivo, en la evaluación de la interferencia de adyuvantes Conclusión: por lo tanto, el método desarrollado demostró ser adecuado para los análisis de control de calidad de rutina para la determinación simultánea de SMT, TMP y BMX en formulaciones farmacéuticas.

SUMMARY Aim: To develop and to validate a simple, sensitive and fast method for the simultaneous determination of sulfamethoxazole (SMT), trimethoprim (TMP) and bromhexine (BMX) in veterinary formulation by high performance liquid chromatography according to the guidelines of the Validation and Control Guide for analytical quality of medicines in food products and veterinary medicines, RDC 166/2017 and international guides International Conference on Harmonization and International Association of Official Analytical Chemists. Materials and methods: The separation was performed on a ThermoScientific® C18 AcclaimTM120 analytical column (4.6 X 250 mm, 5 µm), with a flow rate of 0.7 mL min-1 and detection at 245 nm, 265 nm and 271 nm, for BMX, SMT and TMP, respectively. All measurements were performed in methanol: water (84:16 v/v; pH 3.0). The analytical curves were linear (r > 0.9997) in the concentration range of 15.0 to 30.0 µg-mL-1 for SMT, 3.0 to 9.0 µg-mL-1 for TMP and 0.5 to 2.0 µg-mL-1 for BMX. Results: The method proved to be accurate, with coefficients of variation below the maximum limit of 2.0%, robust, without significant influence of the variations used in the analysis, exact (recovery >99%) and selective, in the assessment of interference from adjuvants. Conclusion: Therefore, the developed method proved to be suitable for routine quality control analyzes for the simultaneous determination of SMT, TMP and BMX in pharmaceutical formulations.

Objetivo: desenvolver e validar um método simples, sensível e rápido para a determinação simultânea de sulfametoxazol (SMT), trimetoprima (TMP) e bromexina (BMX) em formulação veterinária por cromatografia líquida de alta eficiência de acordo com as diretrizes do Validation and Control Guia de qualidade analítica de medicamentos em produtos alimentícios e medicamentos veterinários, RDC 166/2017 e guias internacionais Conferência Internacional de Harmonização e Associação Internacional de Químicos Analíticos Oficiais. Materiais e métodos: a separação foi realizada em coluna analítica ThermoScientific® C18 AcclaimTM120 (4,6 X 250 mm, 5 µm), com vazão de 0,7 mL min-1 e detecção em 245 nm, 265 nm e 271 nm, para BMX , SMT e TMP, respectivamente. Todas as medições foram realizadas em metanol:água (84:16 v/v; pH 3,0). As curvas analíticas foram lineares (r > 0,9997) na faixa de concentração de 15,0 a 30,0 µg-mL-1 para SMT, 3,0 a 9,0 µg-mL-1 para TMP e 0,5 a 2,0 µg-mL-1 para BMX. Resultados: o método mostrou-se preciso, com coeficientes de variação abaixo do limite máximo de 2,0%, robusto, sem influência significativa das variações utilizadas na análise, exato (recuperação >99%) e seletivo, na avaliação da interferência de adjuvantes. Conclusão: portanto, o método desenvolvido mostrou-se adequado para análises de controle de qualidade de rotina para a determinação simultânea de SMT, TMP e BMX em formulações farmacêuticas.

Validación de un método analítico para cuantificación de ferritina en líquido cefalorraquídeo / Validation of an analytical method for the quantification of ferritin in cerebrospinal fluid

Resumen La ferritina es una proteína de gran tamaño que se encuentra fisiológicamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) en concentraciones de 2-10 ng/mL. Su elevación puede utilizarse como biomarcador en distintas condiciones patológicas. El procedimiento de validación tradicional para la medición en LCR no puede ser utilizado debido a la ausencia de controles y calibradores comerciales para esta matriz. El objetivo de este trabajo fue llevar a cabo una validación analítica de ferritina en LCR. Se realizaron ensayos de estimación de precisión y veracidad mediante el protocolo EP15-A3, linealidad por el protocolo EP6-A (ambos de la guía de la CLSI), recuperación, estabilidad, contaminación por arrastre, interferencia por hemólisis y bilirrubina y límite de detección (LoD). La ferritina en LCR en el autoanalizador DxI 800 de Beckman Coulter tuvo una performance intra e interensayo <3,7%, el ensayo denota linealidad en el intervalo de 2,1-547 ng/mL; se estableció estabilidad por un período de 5 días y la recuperación resultó ser aceptable. No se evidenció efecto de contaminación por arrastre ni interferencia por hemólisis hasta un rango entre 300-500 mg/dL de hemoglobina, ni interferencia por bilirrubina hasta una concentración de 16,0 mg/dL de bilirrubina total. El LoD fue de 0,4 ng/mL. Por medio de los ensayos realizados se logró validar la ferritina en LCR a partir de la utilización de pools de muestras, lo que pudo garantizar la confiabilidad y exactitud del método analítico.

Abstract Ferritin is a large protein physiologically present in the cerebrospinal fluid (CSF) in concentrations of 2-10 ng/mL. Its elevation can be used as a biomarker in several pathological conditions. The traditional validation procedure for measurement in CSF cannot be used due to the absence of commercial controls and calibrators for this matrix. The objective of the present study was to perform CSF ferritin analytical validation. Assays such as precision and accuracy estimation through the EP15-A3 protocol, linearity according to the EP6-A protocol (both from the CLSI guidelines), recovery, stability, carry-over, hemolysis and bilirubin interference and limit of detection (LoD) were conducted. Serum samples with different concentrations of ferritin were added to aliquots of a normal CSF pool. CSF ferritin in the Beckman Coulter DxI 800 had a <3.7% intra and inter-assay performance, the assay shows linearity in the 2.1 -547 ng/mL interval, stability was established for a 5-day period and the recovery was acceptable. There was neither carry-over effect or hemolysis interference up to a range of 300-500 mg/dL of hemoglobin, nor interference by bilirubin up to 16.0 mg/dL of total bilirubin. The LoD was 0.4 ng/mL. By means of the performed assays, CSF ferritin was validated by using sample pools, thereby ensuring the reliability and accuracy of the analytical method.

Resumo A ferritina é uma grande proteína fisiologicamente encontrada no líquido cefalorraquidiano (LCR) em concentrações de 2 a 10 ng/mL. Sua elevação pode ser usada como biomarcador em diferentes condições patológicas. O procedimento de validação tradicional para medição no LCR não pode ser usado devido à ausência de controles e calibradores comerciais para esta matriz. O objetivo deste estudo foi realizar uma validação analítica da ferritina no LCR. Foram realizados estudos de precisão e veracidade utilizando o protocolo EP15-A3, linearidade pelo protocolo EP6-A (ambos das diretrizes do CLSI), recuperação, estabilidade, contaminação transportada, interferência de hemólise e bilirrubina e limite de detecção (LoD). A ferritina no LCR no DxI 800 da Beckman Coulter teve um desempenho intra e inter-ensaio <3,7%, o ensaio denota linearidade na faixa de 2,1-547 ng/mL, a estabilidade foi estabelecida em um período de 5 dias e a recuperação foi considerado aceitável. Nenhum efeito de transporte ou interferência por hemólise foi evidenciado até um intervalo entre 300-500 mg/dL de hemoglobina, nem interferência pela bilirrubina até uma concentração de 16,0 mg/dL de bilirrubina total. O LoD foi de 0,4 ng/mL. Através dos testes realizados, a ferritina no LCR foi validada, com base no uso de pool de amostras, o que poderia garantir a confiabilidade e a acurácia do método analítico.

Avaliação toxicológica da exposição à Cannabis e cocaína na gravidez em cordão umbilical humano: validação de método analítico e prospecção de biomarcadores proteicos de toxicidade / Toxicological assessment of Cannabis and cocaine exposure during pregnancy in human umbilical cord tissue: analytical method validation and prospection of protein biomarkers related to fetotoxicity

O abuso de drogas atinge aproximadamente 35 milhões de pessoas em todo planeta, sendo um problema alarmante em decorrência de graves danos à saúde, como a dependência química e intoxicações fatais. No Brasil, o número de usuários tem crescido principalmente para o consumo de produtos da Cannabis e cocaína, drogas amplamente consumidas, inclusive entre mulheres em período gestacional, trazendo à tona um novo grupo de risco. A exposição gestacional a drogas de abuso está diretamente relacionada a malformações fetais e complicações de saúde para mãe e bebê nos períodos pré- e pós-natal. Tradicionalmente, a avaliação toxicológica da exposição é realizada pela detecção da droga parental e de seus produtos de biotransformação em matrizes materno-fetais por meio de métodos bioanalíticos. Entretanto, estes ensaios não fornecem informações acerca dos impactos fisiológicos ocasionados pela exposição, deixando uma lacuna no que tange às informações sobre os mecanismos e moléculas subjacentes envolvidos em processos de toxicidade. Desse modo, o desenvolvimento de análises toxicológicas mais robustas utilizando tecnologia de ponta, que possam comprovar o uso drogas e também elucidar aspectos de toxicidade é de suma importância, pois auxiliam na compreensão do impacto biológico relativo à exposição humana a xenobióticos. Neste trabalho foram desenvolvidos ensaios bioanalíticos, utilizando o tecido do cordão umbilical para a avaliação da exposição in utero à canabinoides. Foi desenvolvido e validado método QuECheRS adaptado como preparo de amostra, no qual etapas simultâneas de extração e hidrólise alcalina de canabinoides são alcançadas, utilizando cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrômetro de massas para detecção de delta-9-tetraidrocanabinol (THC), canabinol (CBN), 11-hidroxi-delta-9-tetraidrocanabinol (11-OHTHC) e 11-nor-9-carboxi-tetrahidrocanabinol (THC-COOH). Também foram desenvolvidas metodologias utilizando LC-MS/MS e Trapped Ion Mobility Mass Spectrometry para análise de proteoma de cordão umbilical humano em diferentes regiões, no intuito de identificar biomarcadores proteicos relativos à fetotoxicidade do uso de drogas na gravidez. Até o presente momento, QuECheRS é utilizado pela primeira vez como abordagem bioanalítica para avaliação de drogas ilícitas em matrizes teciduais materno-fetais e mostrou-se satisfatório para detecção de produtos da Cannabis. Nos ensaios proteômicos, foram identificados potenciais biomarcadores de fetotoxicidade, como as moléculas ACTA 2, Collagen alpha-1 (XVIII), SMC1A, KNL1, KMT2A, em tecidos expostos à Cannabis e/ou cocaína. Tais macromoléculas estão correlacionadas a malformações embriogênicas e complicações de saúde na vida intra-uterina. As metodologias desenvolvidas neste trabalho podem ser úteis para uma melhor avaliação da toxicidade do uso de drogas na gravidez, fornecendo novas pistas sobre a exposição e/ou efeitos tóxicos significativos considerados na avaliação de risco

Drug abuse affects approximately 35 million people worldwide and can be considered a significant burden on society due to severe health problems, e.g. drug addiction and fatal poisonings. In Brazil, the number of users has been growing related to Cannabis and cocaine products, drugs widely used, including among women in gestational period, bringing up a new risk group. Gestational exposure to drugs of abuse is directly related to fetal malformations and health complications for mother and babies in the pre- and postnatal periods. Traditionally, toxicological assessment of exposure is performed by detecting the parent drug and its biotransformation products in maternal-fetal matrices using bioanalytical methods. However, these assays do not provide information about the physiological impacts caused by exposure, leaving a lack of information about the pathways and molecules involved in toxicity processes. Thus, the development of robust toxicological analyzes using cutting-edge technologies in order to prove drug use and also elucidate aspects of toxicity is very important, as they help in understanding the biological impact of human exposure to xenobiotics. Herein, bioanalytical methods using umbilical cord tissue to assess in utero exposure to cannabinoids were developed. A QuECheRS method was developed fully validated as a sample preparation technique for simultaneous extraction and alkaline hydrolysis of cannabinoids, using gas chromatography coupled to mass spectrometry to detect the analytes delta-9-tetrahydrocannabinol (THC), cannabinol (CBN), 11-hydroxydelta-9-tetrahydrocannabinol (11-OH-THC) and 11-nor-9-carboxy-tetrahydrocannabinol (THC-COOH). LC-MS/MS based proteomics and Trapped Ion Mobility Mass Spectrometry were also developed in order to identify protein biomarkers related to fetotoxicity of drug use in pregnancy. Our works represents the first use of QuECheRS for evaluation of illicit drugs in maternal-fetal tissue and was suitable for detection of Cannabis products. In the proteomic assays, potential biomarkers of fetotoxicity were identified in the exposed tissues, such as ACTA 2, Collagen alpha-1 (XVIII), SMC1A, KNL1, KMT2A. These proteins are related to embryogenic malformations and health complications in intrauterine life. The methodologies developed in this project may be useful for a better assessment of the toxicity of drug use in pregnancy, providing new clues about exposure and/or significant toxic effects that should be considered in the risk assessment

Isolamento químico e validação analítica por cromatografia líquida de alta eficiência de quercitrina em Solidago chilensis Meyen (Asteraceae) / Chemical isolation and analytical validation by high-performance liquid chromatography of quercitrin in Solidago chilensis Meyen (Asteraceae)

RESUMO A espécie Solidago chilensis Meyen, Asteraceae é conhecida como erva-lanceta ou arnica-brasileira, sendo utilizada popularmente como antimicrobiana e para o tratamento de inflamações tópicas. No entanto, estudos fitoquímicos e farmacológicos para as partes aéreas são escassos. Neste trabalho, realizou-se a determinação de flavonoides por espectrofotometria de UV/Vis, prospecção fitoquímica da fração acetato de etila visando o isolamento do constituinte químico majoritário e validação analítica por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O teor de flavonoides totais foi de 5,42%, representados como hiperosídeo. O fracionamento químico utilizando métodos cromatográficos (cromatografia líquida em coluna gel de sílica; CHCl3:EtOH; 8:2 v/v) e espectroscópicos (1H RMN,13C RMN e ESI-MS) revelou o isolamento de quercetina-3-O-α-L-ramnosídeo(quercitrina). A sensibilidade e a linearidade (r = 0,999) da validação analítica, utilizando a quercitrina isolada do extrato hidroalcoólico da planta, revelaram um rendimento de 5,29% do analito em relação à droga vegetal. Precisão, recuperação e robustez, além dos valores estabelecidos para os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ), poderão ser utilizados como parâmetros de qualidade para extratos à base de S. chilensis.

ABSTRACT The species Solidago chilensis Meyen Asteraceae, known as “erva-lanceta” or “Brazilian arnica”, is popularly used as an antimicrobial and topical treatment for inflammations. However, phytochemical and pharmacological studies of its aerial parts are scarce. In this study, flavonoids were determined by UV/Vis spectrophotometry and phytochemical screening of the ethyl acetate fraction with the goal of isolating the major chemical constituent and analytically validating it through high performance liquid chromatography (HPLC). The total flavonoid content was 5.42%, represented as hyperoside. Chemical fractionation using chromatographic (liquid chromatography in column of silica gel, CHCl3:EtOH, 8:2 v/v) and spectroscopic methods (1H RMN, 13C RMN, and ESI-MS) revealed the isolation of quercetin-3-O-α-L-rhamnoside (quercitrin). The sensitivity and linearity (r = 0.999) using the isolated quercitrin of the hydroalcoholic extract of the plant revealed a yield of 5.29% of analyte in relation to the plant. Precision, recovery, and robustness, as well as values set for the limits of detection (LOD) and quantitation (LOQ) can be used as quality parameters for extracts based on S. chilensis.

Development and validation of analytical methodology with focus on the qualification of powder mixers / Misturadores de pós/validação analítica; Espectrofotometria; Óxido férrico/quantificação; Lactose monoidratada/análise quantitativa

This study aims at developing an analytical procedure capable of quantifying the ferric oxide present in the mixture of ferric oxide/lactose monohydrate (0.4% w/w). The analytical procedure was checked for specificity, linearity, precision (system repeatability, procedure repeatability and intermediate precision), accuracy, stability of solutions and robustness of the procedure. The concentration of Fe (III) was determined by spectrophotometry at 480 nm based on calibration curves. The specificity was verified. The linearity was obtained in the range of 11.2 to 16.8 µg of ferric oxide/mL. The relative standard deviation (RSD) of the system repeatability, procedure repeatability and intermediate precision, were not more than 2%. The RSD of the accuracy values were less than 0.75%. The stability of the samples was checked over a 24 hours assay. In the robustness evaluation, the wavelength and the concentration of hydrochloric acid varied. The maximum absorbance deviation due to wavelength variation was 0.14 percent, and the maximum deviation due to the hydrochloric acid concentration variation was 2.4%, indicating that the concentration of hydrochloric acid is critical to the analysis of ferric oxide. The procedure developed was validated and is suitable to the performance qualification of powder mixers..

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método analítico capaz de quantificar o óxido férrico presente na mistura óxido férrico/lactose monoidratada (0,4% w/w). Verificou-se a especificidade, linearidade, precisão (repetibilidade do sistema, repetibilidade do método e precisão intermediária), exatidão, estabilidade das soluções e robustez. A concentração de Fe(III) foi determinada por espectrofotometria em 480 nm com base em curvas de calibração. Verificou-se a especificidade verificada. A linearidade foi obtida na faixa de 11,2 a 16,8 µg de óxido férrico/mL. O desvio padrão relativo (DPR) da repetibilidade do sistema, método e precisão intermediária foram inferiores a 2%. Os valores de DPR da exatidão foram inferiores a 0,75%. A estabilidade das amostras foi verificada ao longo de 24 horas de ensaio. Na avaliação da robustez variou-se o comprimento de onda e a concentração de ácido clorídrico. O desvio máximo de absorbância ao se variar o comprimento de onda foi de 0,14%, enquanto que para a concentração de ácido clorídrico o desvio foi de 2,4% para a concentração de 0,8 M. Assim, a concentração de ácido clorídrico é crítica para a análise de óxido férrico. O método desenvolvido foi validado e é adequado à qualificação do desempenho de misturadores de pós e granulados...

Validation of new analytical methodology for determining fenoterolhydrobromide by HPLC: application in pharmaceutical products

Fenoterol hydrobromide is a B2-adrenergic agonist agent used for asthma and chronic obstructive pulmonary disease treatment. HPLC methodology was developed and validated for quantitative determination of fenoterol hydrobromide. The methodology was achieved by using a reversed-phase C18column, (150 mm ¡Á 3.9 mm i.d., 5 ¦Ìm) Thermo. The mobile phase was consisted of acetonitrile: water(30:70, v/v) with 0,1% triethylamine, pH adjusted to 5.0 with formic acid and flow rate of 1.0 mL.min-1with UV detection at 276 nm. The concentration range was from 0.025 to 0.15 mg.mL-1, and the correlation coefficient of analytical curve was >0.999. The detection limit and the quantifying limit (QL) were 0.003mg.mL-1 and 0.012 mg.mL-1, respectively. Intra- and interday relative standard deviations were ¡Ü2.0%. Themetho dology accuracy showed the percentage mean of 99.53%. The described technique was found to be simple, rapid, precise, accurate and sensitive; the advantages over the others current methodologies arethe low-cost and low-polluting conditions. Owing to its simplicity and reliable results, this methodology is suitable to be used in quality control of pharmaceutical drugs containing fenoterol hydrobromide as active componente.