Utilização de biópsia líquida baseada em detecção de DNA tumoral em urina e plasma em pacientes com carcinoma renal de células claras / Use of liquid biopsy based on detection of tumor DNA in urine and plasma in patients with clear cell renal carcinoma

O carcinoma de células renais (CCR) é o sétimo tipo de câncer mais comum no ocidente e vêm apresentando um aumento em sua prevalência. A classificação histológica dos CCRs é a abordagem mais utilizada para determinar o subtipo da doença, bem como prognosticar o paciente. Cerca de 70-80% dos CCRs é do subtipo células claras (ccRCC), o qual representa o subtipo mais prevalente e agressivo da doença. A escolha do tratamento difere para cada paciente, sendo a ressecção cirúrgica a terapia mais efetiva nos casos de doença localizada. Apesar de ser um tratamento já estabelecido, estudos mostram uma certa heterogeneidade entre massas renais detectadas, onde cerca de 20% apresentam um perfil benigno, 60% são considerados tumores indolentes, sugerindo desta forma que, entender de forma mais detalhada este tumor pode auxiliar na escolha de um tratamento mais direcionado para o paciente. Sendo assim, o presente trabalho buscou selecionar genes potencialmente alterados em CCR com o intuito de customizar um painel multigênico capaz de identificar variantes somáticas, específicas do tumor, e avaliar as variantes específicas do tumor de forma personalizada em amostras de ctDNA (DNA tumoral circulante) extraídas de plasma e dos dois componentes da urina (sedimento e sobrenadante) coletados no momento da cirurgia (baseline). Neste contexto, dentro de nossa proposta, construímos um painel com 28 genes associados com CCR e sequenciamos 89 casos de tumores renais, juntamente com as amostras de leucócitos. Identificamos que dentre os tumores analisados, 59 apresentavam pelo menos uma variante somática, ou seja, o painel customizado apresentou uma sensibilidade para identificar variantes somáticas em 66% dos casos. Com relação aos 45 tumores classificados como ccRCC em 38 casos identificamos pelo menos uma marca tumoral, ou seja, nosso painel foi capaz de detectar variantes somáticas específicas do tumor em 84,4% desses casos. Um total de 105 variantes somáticas foram identificadas, e os genes mais frequentemente mutados nessa coorte de pacientes foram os genes VHL, PBRM1, BAP1, SETD2. Dos 59 casos em que identificamos variante somática, 44 casos foram avaliados as amostras baseline de plasma e 29 casos de urina (sobrenadante e sedimento), e encontramos pelo menos uma marca tumoral em um dos fluidos corpóreos em 11 pacientes, 6 em amostras de plasma e 6 amostras de urina. Através do desenvolvimento deste estudo, confirmamos que o subtipo ccRCC é o CCR mais bem caracterizado genomicamente e que é importante continuar a investigação genômica principalmente nos subtipos não ccRCC. Além disso o estudo demonstra a viabilidade de utilizar biópsia líquida ctDNA tanto no plasma quanto na urina para fins de diagnóstico e prognóstico.

Renal cell carcinoma (RCC) is the seventh most common type of cancer in the West and its prevalence is increasing. The histological classification of RCCs is the most used approach to determine the disease subtype as well as the patient's prognosis. About 70% of RCCs are of the clear cell Renal Cell Carcinoma subtype (ccRCC), which represents the most prevalent and aggressive subtype of the disease. The choice of treatment is different for each patient. Resection is one of the most effective therapies in cases of localized disease. Despite being an established treatment, studies show a certain heterogeneous profile studied. In this profile, up to 20% even present a benign treatment, helping the indolent, thus suggesting that understanding this tumor in detail can help to choose a more targeted treatment for the patient. Therefore, the present work aimed to select potentially altered genes in CCR in order to customize a multigene panel capable of identifying somatic, tumor-specific variants, and to evaluate the tumor-specific variants in a personalized way in ctDNA (circulating tumor DNA) samples extracted from plasma and from two components of urine (sediment and supernatant) collected at the time of surgery (baseline). In this context, within our proposal, we built a panel with 28 genes associated with CCR and sequenced 89 cases of renal tumors, together with leukocyte samples. We identified that among the analyzed tumors, 59 had at least one somatic variant, that is, the customized panel showed sensitivity to identify somatic variants in 66% of cases. Of the 45 classified as ccRCC in 38 cases we identified at least one tumor marker, that is, our panel was able to detect tumor-specific somatic variants in 84.4%. A total of 105 somatic variants were identified, and the genes most frequently mutated in this cohort of patients were the VHL, PBRM1, BAP1, SETD2 genes. Among 59 cases in which we identified somatic variant, 44 cases were evaluated in baseline plasma samples and 29 cases in urine (supernatant and sediment), and we found at least one tumor mark in one of the body fluids in 11 patients, 6 in plasma samples and 6 urine samples. Through the development of this study, we confirm that the ccRCC subtype is the best genomically characterized CCR and that it is important to continue genomic investigation, especially in the non-ccRCC subtypes. Furthermore, the study demonstrates the feasibility of using ctDNA liquid biopsy in both plasma and urine for diagnostic and prognostic purposes.

Perfil genômico da síndrome do xeroderma pigmentoso no Brasil: avaliação de alterações germinativas e somáticas / Genomic profile of xeroderma pigmentosum syndrome in Brazil: assessment of germline and somatic alterations

A síndrome do Xeroderma Pigmentoso (XP) ocorre frente à herança monogênica e bialélica de variantes germinativas patogênicas de perda ou redução de função em genes das vias de reparo por excisão de nucleotídeos ou síntese translesão. Consequentemente, é estabelecida deficiência na correção de lesões induzidas, principalmente por radiação ultravioleta, favorecendo alta sensibilidade à radiação solar e risco aumentado para o desenvolvimento de múltiplas lesões cutâneas pré-malignas e malignas. Visto que a heterogeneidade na manifestação clínica da síndrome é uma questão em discussão na literatura, para investigar este aspecto propusemos avaliar o perfil de variantes germinativas e variantes somáticas de tumores cutâneos e não cutâneos de indivíduos portadores de XP. Foi realizado o sequenciamento de alto desempenho utilizando a plataforma NextSeq (Illumina) para avaliar as regiões codificantes de 114 genes selecionados pela sua relevância em desordens dermatológicas, tumorigênese e fisiologia cutânea e resposta de dano ao DNA. Seis pacientes com fenótipo clínico da síndrome do XP e portadores de variantes germinativas clinicamente relevantes nos genes XPC ou POLH/XPV foram avaliados no estudo. Variantes germinativas de significado incerto foram identificadas, em heterozigose, no DNA de leucócito de cinco dos seis pacientes avaliados ocorrendo nos genes DNAH11, PCDHB3, RGS22, SLC27A5, TTN e UGT2B10 e nenhuma das variantes identificadas apresentou perda de heterozigose do alelo selvagem nos tecidos tumorais. O polimorfismo de risco para carcinoma basocelular de pele (CBC) rs3769823[A] no gene CASP8 não foi identificado em apenas um caso do estudo, o qual desenvolveu o menor número de tumores. O polimorfismo de risco rs1126809[A] no gene TYR foi detectado apenas no caso que apresentou o maior número de CBC. Amostras de DNA de nove CBCs de tecido armazenado em parafina e duas amostras de tumor gástrico de uma mesma peça cirúrgica, de tecido armazenado em parafina e congelado a fresco, foram avaliadas de forma pareada com o DNA de leucócito correspondente, para pesquisa de variantes somáticas. Variantes somáticas não foram identificadas na amostra de CBC da paciente XP-C com fenótipo menos agressivo da síndrome. O total de 235 variantes missense e 29 variantes de perda de função foram identificadas em 71 genes para sete amostras de CBC, mínimo de 11 e máximo de 127 variantes por amostra, com 85,2% destas apresentando frequência alélica ≥20%. Com exceção de um CBC, mais de 95% das variantes somáticas identificadas representam alterações tipicamente fotoinduzidas (C:G>T:A e G:C>T:A). Embora pacientes XP acumulem maior número de mutações devido deficiência no mecanismo de reparo, não observamos carga mutacional diferente do observado em CBCs esporádicos. Vinte e sete genes apresentaram variantes somáticas em mais de uma amostra de CBC. Nenhum gene foi compartilhado entre as sete amostras de CBC. Entre os genes alterados em maior número de tumores estão incluídos genes drivers de CBC (LATS1, NOTCH2, PTCH1, PTPN14 e TP53), bem como genes não clássicos na carcinogênese do CBC (APC, FLG e TTN). Uma variante driver em SMO foi recorrente em três CBCs de um mesmo paciente. Duas variantes somáticas foram identificadas no tumor gástrico de tecido congelado a fresco ocorrendo nos genes GLI3 e RB1, não sendo as mesmas detectadas no tecido armazenado em parafina. Nesse trabalho, ressalta-se a heterogeneidade na manifestação clínica da síndrome do XP e a identificação de dois polimorfismos de risco, bem como destaca-se o papel central das vias Sonic Hedgehog e Hippo na carcinogênese do CBC de pacientes XP (AU)

The Xeroderma Pigmentosum (XP) syndrome occurs on base of biallelic inheritance of pathogenic germline variants of loss of function or function reduction in genes that plays role in nucleotide excision repair and translesion synthesis. Consequently, patients are deficient in correct DNA lesions mainly induced by ultraviolet radiation, present high sensitivity to solar radiation and increased risk for the development of multiple premalignant and malignant skin lesions. Since the heterogeneity in the clinical manifestation is under constantly discussion in the literature, to investigate it we proposed to explore the profile of germline variants and somatic variants in skin and non-skin tumors from XP patients. High-performance sequencing using the NextSeq (Illumina) platform was performed to assess the coding regions of 114 genes selected for their relevance in dermatological disorders, skin carcinogenesis, cutaneous physiology and DNA damage response. Six patients with clinical phenotype of XP syndrome and carriers of clinically relevant germline variants in the XPC or POLH/XPV genes were evaluated in the study. Heterozygous germline variants of uncertain significance were identified in the leukocyte DNA from five of the six patients occurring in DNAH11, PCDHB3, RGS22, SLC27A5, TTN and UGT2B10 genes. None of the identified variants showed loss of heterozygosity of the wild allele in tumor tissues. The CASP8 risk polymorphism for basal cell carcinoma of the skin (BCC) rs3769823[A] was not identified in only one case of the study which developed the minor number of tumors. The TYR risk polymorphism rs1126809[A] was detected only in the case with the highest number of BCC. Somatic variants were investigated in DNA from nine samples of BCCs (tissue stored in paraffin) and two samples of gastric tumor from the same surgical (tissue stored in paraffin and fresh frozen), all paired with the corresponding leukocyte DNA. Somatic variants were not identified in the BCC sample of XP-C patient with a less aggressive syndrome phenotype. A total of 235 missense variants and 29 loss of function variants were identified in 71 genes for seven BCC samples. A minimum of 11 and a maximum of 127 variants per sample were detected, with 85.2% showing an allelic frequency ≥20%. Except for one BCC, more than 95% of the identified somatic variants represented typically photoinduced mutations (C:G>T:A and G:C>T:A). Although XP patients accumulate a greater number of mutations due to deficiency in the repair mechanism, we did not observe different mutational load compared with sporadic BCCs. Twenty-seven genes showed somatic variants in more than one BCC sample. Genes shared between the seven BCC samples were not found. Among the altered genes in a greater number of tumors, it was identified BCC driver genes (LATS1, NOTCH2, PTCH1, PTPN14 and TP53), as well as genes non-classical for BCC carcinogenesis (APC, FLG and TTN). A driver variant in SMO was recurrent in three BCCs from the same patient. Two somatic variants in GLI3 and RB1 genes were identified occurring only in the fresh frozen tissue of gastric tumor, not in the tissue stored in paraffin. In this work, the heterogeneous clinical manifestation of XP syndrome is highlighted, as well as the identification of two risk polymorphisms. In addition, this work emphasizes the central role of the Sonic Hedgehog and Hippo pathways in BCC carcinogenesis of XP patients.