Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R² =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R² =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Caracterização do secretoma de cepas de Xylella fastidiosa / Characterization of the secretome Xylella fastidiosa strains

As doenças causadas pelo fitopatógeno Xylella fastidiosa, uma bactéria Gram-negativa, devem-se aos seus múltiplos fatores de virulência, tais como formação de biofilme, secreção de enzimas de degradação da parede celular do xilema (CWDE), expressão de proteínas de adesão e produção de vesículas de membrana externa (OMVs). Esses fatores de virulência são controlados por uma via de sinalização mediada por DSF (fatores de sinalização difusíveis de natureza lipídica) e relacionada com percepção de quórum. Nesse trabalho, tivemos como objetivo ampliar a caracterização do secretoma de cepas selvagens e mutantes de X. fastidiosa para evidenciar proteínas e metabólitos potencialmente associados à adaptação ao hospedeiro, virulência e patogenicidade. Desenvolvemos, paralelamente, três estudos empregando como abordagens metodológicas a proteômica, a metabolômica e a transcritômica. No primeiro estudo, comparamos o secretoma (exoproteoma) da cepa Temecula1 selvagem (WT) e do mutante no gene da sintase de DSF (ΔrpfF), o qual exibe fenótipo de hipervirulência em videiras. A este estudo associamos a comparação dos transcritomas dessas cepas. Os resultados mostraram que, mesmo no cultivo in vitro, X. fastidiosa expressa e secreta fatores de virulência previamente conhecidos (lipases-esterases e proteases), além de toxinas (microcinas) que, supostamente, teriam papel de controlar bactérias competidoras pelo mesmo nicho. No segundo estudo caracterizamos a composição de OMVs secretadas no cultivo in vitro por X. fastidiosa Fb7 e 9a5c (cepas isoladas de laranjeiras) e Temecula1 (cepa isolada de videira). Demonstramos que Fb7 produz até 57% mais OMVs que 9a5c e Temecula1 e identificamos um total de 202 proteínas distintas nas OMVs produzidas pelas 3 cepas, ampliando consideravelmente o número de proteínas secretadas por meio de OMVs descrito, até então, para X. fastidiosa. Entre as proteínas enriquecidas, citamos adesinas afimbriais, porinas, lipoproteínas, hidrolases (lipases/esterases, proteases e peptidases) e uma pectina-liase putativa. Destacamos a detecção da enzima L-ascorbato oxidase nas OMVs e sugerimos que esta enzima poderia atuar na depleção do ascorbato produzido pelo hospedeiro vegetal. Além disso, demonstramos, pela primeira vez, que OMVs de X. fastidiosa transportam ácidos graxos da família DSF, sugerindo um papel adicional para OMVs nesse fitopatógeno. Finalmente, no terceiro estudo verificamos alterações relevantes no perfil de metabólitos secretados por X. fastidiosa em resposta a sua interação com metabólitos secretados por Burkholderia phytofirmans, proposta como uma cepa para o biocontrole da doença de Pierce de videiras. Confirmamos que o sobrenadante de B. phytofirmans possui um composto de natureza apolar que induz a formação de biofilme em X. fastidiosa, contudo ainda não foi possível decifrar a natureza química deste composto

The diseases caused by the phytopathogen Xylella fastidiosa, a Gram-negative bacterium, are due to multiple virulence factors, such as biofilm formation, secretion of xylem cell wall degradation enzymes (CWDE), expression of adhesion proteins and production of outer membrane vesicles (OMVs). These virulence factors are controlled by a DSF (diffusible signaling factors of a lipidic nature) mediating signaling pathway and related to quorum sensing perception. In this work, we aimed to extend the characterization of the secretoma of wild type and mutants strains of X. fastidiosa to uncover proteins and metabolites potentially associated to host adaptation, virulence and pathogenicity. We developed three studies in parallel using proteomics, metabolomics and transcriptomics as methodological approaches. In the first study, we compared the secretome (exoproteome) of the wild type strain Temecula1 (WT) and of DSF synthase mutant (ΔrpfF) which exhibits hypervirulence phenotype in grapevines. We also compared the transcriptomes of these strains. Our results showed that, even in in vitro culture, X. fastidiosa expresses and secretes previously known virulence factors (lipasesesterases and proteases), as well as toxins (microcins) that might play a role in controlling competing bacteria in the same niche. In the second study, we characterized the composition of OMVs secreted by in vitro cultures of X. fastidiosa Fb7 and 9a5c (strains isolated from orange trees) and Temecula1 (strain isolated from grapevine). We have shown that Fb7 produces up to 57% more OMVs than the 9a5c and Temecula1. Moreover we identified a total of 202 distinct proteins in the OMVs produced by these three strains, increasing considerably the number of OMVs secreted proteins so far described for X. fastidiosa. Among the proteins enriched in OMVs, we point out afimbrial adhesins, porins, lipoproteins, hydrolases (lipases/esterases, proteases and peptidases) and a putative pectin-lyase. We highlight the detection of the enzyme L-ascorbate oxidase in the OMVs and we suggest that this enzyme could act in the depletion of ascorbate produced by the plant host. In addition, we have demonstrated, for the first time, that X. fastidiosa OMVs transport fatty acids from the DSF family, suggesting an additional role for OMVs in this phytopathogen. Finally, in the third study we verified relevant changes in the profile of metabolites secreted by X. fastidiosa in response to the interaction with metabolites secreted by Burkholderia phytofirmans that has been sugested as a biocontrol strain for Pierce's disease in grapevines. We confirm that the B. phytofirmans supernatant has a non-polar compound that induces biofilm formation in X. fastidiosa, but it has not yet been possible to elucidate the chemical nature of this compound