Antimicrobial activity of violacein against oral bacteria associated with halitosis: an in vitro study

Introduction: violacein is a natural purple pigment produced by environmental bacteria that presents antimicrobial activity, particularly against Gram-positive bacteria. Intraoral halitosis (IOH) is a condition defined by the unpleasant odor emanating from the mouth, whose main source are volatile sulfur compounds, produced by Gram-negative oral bacteria on the tongue coating. In IOH treatment, antimicrobials have been indicated as chemical adjuncts, including natural products. Objective: thus, this study tested the antimicrobial activity of a violacein extract on key IOH-related bacteria (Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Solobacterium moorei). Materials and Methods: bacteria were cultured in fastidious anaerobe blood agar in anaerobiosis, and 109 cells/ml suspensions were plated. Crude extract of violacein obtained from Chromobacterium violaceum was diluted in a 25% ethanol aqueous solution to 8, 4, 2, 1, 0.5 and 0.25 mg/ml. Using the disk agar diffusion method, 10 µl aliquots of each dilution were deposited on the seeded plates. Chlorohexidine (0.1%) and 25% ethanol solution were used as controls. Plates were incubated in anaerobiosis at 37°C for 72h, and the inhibition halos were recorded. Results: although chlorhexidine showed higher inhibition halos than the violacein extract, most species were inhibited at 4 and 8 mg/ml concentrations (p<0.05). P. gingivalis followed by F. nucleatum were the most affected species in relation to the other bacteria, although statistical significance was only reached for P. gingivalis (p<0.05). Conclusion: crude violacein extract from C. violaceum demonstrated antimicrobial activity against IOH-associated oral bacteria, being a potential antimicrobial to be studied as an adjunct in the control of IOH.

Introdução: a violaceína é um pigmento roxo natural produzido por bactérias ambientais que apresenta ação antimicrobiana, particularmente contra bactérias Gram-positivas. A halitose intraoral (HIO) é uma condição definida pelo odor desagradável que emana da boca, cuja principal fonte são os compostos sulfurados voláteis produzidos por bactérias Gram-negativas da saburra lingual. No tratamento da HIO, antimicrobianos têm sido indicados como adjuvantes, incluindo produtos naturais. Objetivo: assim, este estudo avaliou o potencial antimicrobiano de um extrato de violaceína em patógenos-chave da HIO (Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Solobacterium moorei). Materiais e Métodos: bactérias foram cultivadas em meio ágar sangue para fastidiosos, em anaerobiose, e suspensões de 109 células/ml foram semeadas. O extrato bruto de violaceína obtido de Chromobacterium violaceum foi diluído em solução aquosa com 25% de etanol nas concentrações de 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 mg/ml. Através do método de disco difusão, 10 µl de cada diluição foram depositados nas placas semeadas. A clorexidina (0,1%) e a solução etanólica a 25% foram usadas como controles. As placas foram incubadas em anaerobiose a 37°C por 72h, e os halos de inibição foram registrados. Resultados: embora a clorexidina tenha apresentado os maiores halos de inibição do do que o extrato, a maioria das espécies foi inibida nas concentrações de 4 e 8 mg/ml (p<0,05). P. gingivalis e F. nucleatum foram as espécies mais afetadas em relação às outras bactérias, porém só foi observada significância estatística para P. gingivalis (p<0,05). Conclusão: o extrato bruto de violaceína de C. violaceum demonstrou atividade antimicrobiana contra bactérias orais associadas a HIO, sendo um potencial antimicrobiano a ser estudado como adjuvante no controle da HIO.

Inibição do sistema quorum sensing AI-1 por Capsicum frutescens e Capsicum annuum em bactérias Gram-negativas / Inhibition of AI-1 quorum-sensing system by Capsicum frutescens and Capsicum annuum in Gram-negative bacteria

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 µg/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 µg/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 µg/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho

Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 µg/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 µg/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 µg/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work

Efeito da violaceína sobre formas evolutivas de trypanosoma cruzi

A Organização Mundial de Saúde estima que aproximadamente 7 a 8 milhões de pessoas encontram-se infectadas pelo Trypanosoma cruzi no mundo. O tratamento da doença de Chagas apresenta eficácia limitada e efeitos colaterais que limitam a tolerabilidade e a adesão dos pacientes. A busca de novas alternativas terapêuticas a partir de substâncias bioativas cresceu bastante nos últimos anos. A violaceína (VIO), um pigmento bacteriano produzido por Chromobacterium violace um tem mostrado diversas ações biológicas, dentre elas, ações antiulcerogênica, antitumoral, antiviral e antiparasitária. No presente trabalho, estudamos os efeitos da VIO sobre as formas evolutivas doTrypanosoma cruzi. As formas epimastigotas foram cultivadas em meio LIT, a 28°C, na presença deVIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000μM) por 24, 48 e 72h. As formas tripomastigotas, foram obtidas após infecção em células LLC-MK2, ressuspensas em meio DMEM2% de SBF e incubadas com VIO (0,97; 1,9; 3,9; 7,8; 15,62; 31,25μM) por 24h. Formas amastigotas foram cultivadas em lamínulas circulares no interior de placas de cultura contendo células LLC-MK2e tratadas com violaceína (4,97 e 9,94 μM)...

The World Health Organization estimates that approximately 7 to 8 million individuals areinfected with Trypanosoma cruzi worldwide. The treatment of Chagas disease has limited efficacy andside effects that limit patient tolerability and compliance. The search for new therapeutic alternativesbased on bioactive substances has increased significantly in recent years. Violacein (VIO), a bacterialpigment produced by Chromobacterium violaceum, has shown several biological actions and amongthem, antiulcer, antitumor, antiviral, and antiparasitic action. In this study, we assessed the effects ofVIO on the evolutionary forms of Trypanosoma cruzi. Epimastigotes were cultured in liver infusiontryptose (LIT) medium at 28 °C in the presence of VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8; 15.62; 31.25; 62.5; 125;250 ; 500; 1000μM) for 24, 48 and 72 hours. Trypomastigotes were obtained after infection in LLCMK2cells resuspended in 2% DMEM medium of FBS and incubated with VIO (0.97; 1.9; 3.9; 7.8;15.62; 31.25μM ) for 24h. Amastigotes were cultured on circular glass slides within culture platescontaining LLC-MK2 cells and treated with violacein (4.97 and 9.94 μM)...