Influence of different protein supplements on the recovery and in vitro maturation of bovine oocytes / Influencia de diferentes suplementos proteicos en la recuperación y maduración in vitro de ovocitos bovinos / Influência de diferentes suplementações proteicas sobre a recuperação e maturação in vitro de oócitos bovinos

Abstract Background: Oocyte quality and maturation are influenced by protein supplementation. Objective: To evaluate the influence of fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) concentrations on the recovery and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. Methods: The study was divided into Stage 1 (oocyte recovery), and Stage 2 (IVM). In the first stage, three experiments were conducted according to the recovery (R) medium used: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; and (R3) the best results from R1, R2, and the combination of FBS+BSA (5+5%). Within the second stage, the maturation medium was supplemented according to three experiments: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0.4 vs. 0.8% BSA; and (M3) better results of M1, M2, and the combination of FBS+BSA (5+0.8%). Results: In Stage 1 (R1 and R2), the media with 10% FBS and 10% BSA showed better oocyte quality results and were defined for experiment R3. In R3, the 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) allowed recovery of better-quality oocytes. In Stage 2 (M1 and M2), media with both levels of FBS (5 and 10%) and 0.8% BSA were defined as better according to the maturation and viability rates of cumulus cells, so they were defined for experiment M3. In M3, no difference was noted among the supplements. Conclusions: For oocyte recovery, 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) can be used to obtain immature oocytes. For the in vitro maturation, FBS (both levels, 5 and 10%) and BSA (0.8%) can be used alone or in combination.

Resumen Antecedentes: La calidad y maduración de los ovocitos son influenciados por la suplementación proteica. Objetivo: Evaluar la influencia de concentraciones de suero fetal bovino (FBS) y albúmina sérica bovina (BSA) en la recuperación y maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos. Métodos: El estudio se dividió en Etapa 1 (recuperación de ovocitos) y Etapa 2 (IVM). En la primera etapa, tres experimentos se realizaron de acuerdo con el medio de recuperación: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; y (R3) los mejores resultados de R1, R2 y la combinación de FBS+BSA (5+5%). En la segunda etapa, el medio de maduración fue suplementado para tres experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; y (M3) mejores resultados de M1, M2 y la combinación de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: En la Etapa 1 (R1 y R2), los medios con 10% FBS y 10% BSA mostraron mejores resultados de calidad oocitaria y fueron definidos para el experimento R3. En R3, 10% FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) permitieron la recuperación de ovocitos de mejor calidad. En la Etapa 2 (M1 y M2), los medios con ambos niveles de FBS (5 y 10%) y 0,8% de BSA se definieron como mejores de acuerdo con las tasas de maduración y viabilidad de las células del cumulus, por lo que se definieron para el experimento M3. En M3, no se observó diferencia entre los suplementos. Conclusiones: Para la recuperación de ovocitos, se puede utilizar 10% de FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) para obtener ovocitos inmaduros. Para la maduración in vitro, FBS (ambos niveles, 5 y 10%) y BSA (0,8%) se pueden usar solos o en combinación.

Resumo Antecedentes: A qualidade e a maturação de oócitos são influenciadas pela suplementação proteica. Objetivo: Avaliar a influência de concentrações de soro fetal bovino (FBS) e albumina sérica bovina (BSA) sobre a recuperação e maturação in vitro (IVM) de oócitos bovinos. Métodos: O estudo foi dividido em Etapa 1 (recuperação de oócitos) e Etapa 2 (IVM). Na primeira etapa, três experimentos foram realizados de acordo com o meio de recuperação: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; e (R3) melhores resultados de R1, R2 e a combinação de FBS+BSA (5+5%). Na segunda etapa, o meio de maturação foi suplementado de acordo com três experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; e (M3) melhores resultados de M1, M2 e a combinação de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: Na Etapa 1 (R1 e R2), os meios com 10% FBS e 10% BSA mostraram melhores resultados de qualidade oocitária e foram definidos para o experimento R3. Em R3, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) permitiram a recuperação de oócitos de melhor qualidade. Na segunda etapa (M1 e M2), meios com ambos os níveis de FBS (5 e 10%) e 0,8% BSA foram definidos como os melhores de acordo com as taxas de maturação e viabilidade de células do cumulus, então foram definidos para o experimento M3. No M3, não houve diferença entre os suplementos. Conclusões: Para a recuperação oocitária, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) podem ser usados para obter oócitos imaturos. Para maturação in vitro, FBS (ambos os níveis, 5 e 10%) e BSA (0,8%) podem ser usados sozinhos ou em combinação.

Detection and genetic identification of pestiviruses in Brazilian lots of fetal bovine serum collected from 2006 to 2014 / Detecção e identificação genética de pestivírus em lotes brasileiros de soro fetal bovino coletado de 2006 a 2014

The present study performed a genetic identification of pestiviruses contaminating batches of fetal bovine serum (FBS) produced in Brazil from 2006 to 2014. Seventy-three FBS lots were screened by a RT-PCR targeting the 5'untranslated region (UTR) of the pestivirus genome. Thirty-nine lots (53.4%) were positive for pestivirus RNA and one contained infectious virus. Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of the 5'UTR revealed 34 lots (46.6%) containing RNA of bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), being 23 BVDV-1a (5' UTR identity 90.8-98.7%), eight BVDV-1b (93.9-96.7%) and three BVDV-1d (96.2- 97.6%). Six lots (8.2%) contained BVDV-2 (90.3-100% UTR identity) being two BVDV-2a; three BVDV-2b and one undetermined. Four FBS batches (5.5%) were found contaminated with HoBi-like virus (98.3 to 100%). Five batches (6.8%) contained more than one pestivirus. The high frequency of contamination of FBS with pestivirus RNA reinforce the need for systematic and updated guidelines for monitoring this product to reduce the risk of contamination of biologicals and introduction of contaminating agents into free areas.(AU)

No presente estudo foi realizada a identificação genética de pestivírus contaminantes de lotes de soro fetal bovino (SFB) produzidos no Brasil de 2006 a 2014. Setenta e três lotes de SFB foram testados por RT-PCR para a região 5' não traduzida do genoma dos pestivírus. Trinta e nove lotes (53,4%) foram positivos para RNA de pestivírus e um continha vírus infeccioso. O sequenciamento de nucleotídeos e análise filogenética da região 5'UTR revelou que 34 lotes (46,6%) continham RNA do vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), sendo 23 BVDV-1a (identidade na 5' UTR de 90,8-98,7%), oito BVDV-1b (93,9 a 96,7%) e três BVDV-1d (96,2%-97,6%). Seis lotes (8,2%) continham BVDV-2 (90,3 a 100% de identidade), sendo dois BVDV-2a, três BVDV-2b e um de subgenótipo indeterminado. Quatro lotes de SFB (5,5%) estavam contaminados com o vírus HoBi-like (98,3 a 100%). Cinco lotes (6,8%) continham mais do que um pestivírus. A alta frequência de contaminação de SFB com RNA de pestivírus reforça a necessidade para diretrizes sistemáticas atualizadas para a monitoração deste produto com a finalidade de reduzir a contaminação de produtos biológicos e a introdução de agentes contaminantes em áreas livres.(AU)

Supplementation of fetal bovine serum alters histone modification H3R26me2 during preimplantation development of in vitro produced bovine embryos / Suplementação com soro fetal bovino altera a modificação de histona H3R26me2 durante o período pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro

In vitro production (IVP) of bovine embryos is not only of great economic importance to the cattle industry, but is also an important model for studying embryo development. The aim of this study was to evaluate the histone modification, H3R26me2 during pre-implantation development of IVP bovine embryos cultured with or without serum supplementation and how these in vitro treatments compared to in vivo embryos at the morula stage. After in vitro maturation and fertilization, bovine embryos were cultured with either 0 or 2.5% fetal bovine serum (FBS). Development was evaluated and embryos were collected and fixed at different stages during development (2-, 4-, 8-, 16-cell, morula and blastocyst). Fixed embryos were then used for immunofluorescence utilizing an antibody for H3R26me2. Images of stained embryos were analyzed as a percentage of total DNA. Embryos cultured with 2.5% FBS developed to blastocysts at a greater rate than 0%FBS groups (34.85±5.43% vs. 23.38±2.93%; P<0.05). Levels of H3R26me2 changed for both groups over development. In the 0%FBS group, the greatest amount of H3R26me2 staining was at the 4-cell (P<0.05), 16-cell (P<0.05) and morula (P<0.05) stages. In the 2.5%FBS group, only 4-cell stage embryos were significantly higher than all other stages (P<0.01). Morula stage in vivo embryos had similar levels as the 0%FBS group, and both were significantly higher than the 2.5%FBS group. These results suggest that the histone modification H3R26me2 is regulated during development of pre-implantation bovine embryos, and that culture conditions greatly alter this regulation...

A produção in vitro (PIV) de embriões de bovinos não é apenas de grande importância econômica para a pecuária, mas é também um importante modelo para estudar o desenvolvimento embrionário. O objetivo deste estudo foi avaliar a modificação de histona, H3R26me2 durante o desenvolvimento pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro, cultivados com ou sem suplementação de soro fetal bovino (SFB), bem como comparar essa modificação específica entre mórulas produzidas in vitro e in vivo. Após a maturação in vitro e fertilização, embriões foram cultivados com suplementação de 0 ou 2,5% SFB. O desenvolvimento embrionário foi avaliado e embriões foram coletados e fixados em diferentes fases durante o desenvolvimento (2, 4, 8 e 16 células, mórula e blastocisto). Os embriões fixados foram avaliados por imunofluorescência utilizando um anticorpo para H3R26me2. Imagens de embriões corados foram analisadas baseadas na porcentagem do DNA total. Embriões cultivados com 2,5% SFB tiveram uma taxa de desenvolvimento ao estágio de blastocisto maior que o grupo que não recebeu suplementação com SFB (34.85±5,43% vs 23.38±,93%; P<0,05). Níveis de H3R26me2 variaram para ambos os grupos ao longo do desenvolvimento. No grupo 0% SFB, a marcação para H3R26me2 foi mais intensa nos estágios de 4 células (P<0,05), 16 células (P<0,05) e mórula (P<0.05). No grupo 2.5% SFB, apenas os embriões de 4 células tiveram marcação significativamente maior que todas as outras fases (P<0,01). Mórulas produzidas in vivo apresentaram níveis de H3R26me2 semelhantes ao grupo 0% SFB, e ambos foram significativamente maiores que o grupo 2.5% SFB. Estes resultados sugerem que a modificação de histona H3R26me2 é regulada durante o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos, e que as condições de cultura alteram de maneira importante esta regulação...

Efeitos da redução ou substituição do soro fetal bovino por outros compostos na maturação in vitro de oócitos bovinos / Effects of reduction or replacement of fetal calf serum by other compounds during in vitro maturation of bovine oocytes

A utilização do soro fetal bovino (SFB), embora bastante disseminada na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, apresenta limitações por ser um meio indefinido e por causar efeitos que prejudicam a qualidade desses embriões. Por esse motivo, nos últimos anos, grande parte das pesquisas relacionadas à PIV está voltada para a substituição do SFB por outros compostos nos meios de cultura. No presente estudo, foram utilizados como compostos protéicos a albumina sérica bovina livre de ácidos graxos (BSA-FAF) e um produto comercial denominado fluido embriônico (FE) de maneira isolada ou em diferentes combinações e concentrações, com objetivo de substituir ou diminuir a concentração do SFB durante a maturação in vitro (MIV). [...] Ademais, o G3 também apresentou diminuição na taxa de maturação nuclear quando comparado ao G4. Quanto à maturação citoplasmática, nos grupos G2, G7, G6 e G3, houve redução (p<0,05) das taxas para 43,9por cento, 43,2 por cento, 43,1 por cento e 36,5 por cento, respectivamente, quando comparadas ao meio controle (G1), que permitiu a obtenção de valores médios de 62,4 por cento. Por outro lado, nos grupos G8, G4 e G5, a taxa de maturação citoplasmática não foi afetada com a redução do SFB, onde 59,3 por cento, 51,3 por cento e 50,8 por cento dos oócitos apresentaram os GC dispostos na periferia, respectivamente. Os resultados obtidos pelo teste de contrastes ortogonais complementam os obtidos na avaliação da maturação nuclear e migração de grânulos corticais, mostrando a necessidade do SFB durante a MIV, mesmo que em baixas concentrações, e a possibilidade de diminuir a sua concentração associando-o a BSA-FAF e/ou FE. Dessa forma, conclui-se que é possível reduzir a concentração de SFB no meio de MIV para até 3,5% sem prejuízo significativo aos índices de maturação nuclear e citoplasmática.

The use of fetal calf serum (FCS), although widely employed during in vitro production (IVP) of bovine embryos, has limitations. FCS is an undefined media and may have harmful effects on the quality of embryos. For this reason, in recent years, research efforts aimed at improving IVP of bovine embryos, have focused at the replacement of FCS by alternative compounds in culture media. In this study, fatty acid free bovine serum albumin (BSA-FAF) and embryonic fluid (EF) were used separately or in combination, in different concentrations, to replace or reduce the concentration of FCS during in vitro maturation (IVM). [...] Moreover, G3 also showed inferior nuclear maturation rate when compared to G4. Regarding cytoplasmic maturation, the rates were reduced to 43.9 percent, 43.2 percent, 43.1 percent and 36.5 percent in G2, G7, G6 and G3 groups, respectively, compared to the control group (G1; 62.4 percent). On the other hand, in the groups G8, G4 and G5, maturation rates were not affected by reduction of FCS, where 59.3 percent, 51.3 percent and 50.8 percent of the oocytes displayed CG arranged peripherally, respectively. The results obtained by the orthogonal contrast test are in accordance with the ones from the evaluation of the nuclear maturation and cortical granules migration. These data show the need of FCS on the MIV, even in low concentrations, and the possibility of decrease its concentration by associating it with BSA-FAF and/or EF. Therefore, we concluded that it is possible to reduce the concentration of FCS in IVM medium to a concentration of 3.5 percent without affecting nuclear and cytoplasmic maturation rates.

Detection of seven viruses and Mycoplasma in fetal bovine serum by real time PCR / Detección de siete virus y de Mycoplasma en suero fetal bovino por PCR en tiempo real / Detecção de sete vírus e de Mycoplasma em soro fetal bovino por PCR em tempo real

Objective: real time PCR analysis for the detection of seven bovine pathogenic viruses: Bovine Adenovirus (BAdV), Bovine Viral Diarrhea Virus Types 1 and 2 (BVDV-1 and BVDV-2), Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV), Vesicular Stomatitis Virus (VSV), Bovine Parainfluenza Virus 3 (BPIV-3), Bovine Herpes Virus-1 (BoHV-1), and Mycoplasma was conducted using fetal bovine serum (FBS, MICROGEN®) obtained in Colombia, aiming to include it as part of the serum quality control. Methods: bovine derived MDBK and human derived HEp-2 cell lines were cultured with the test serum for 21 days, collecting supernatant and cellular samples every 7-days. Once DNA and RNA were extracted, the later was converted into cDNA and both samples were subjected to real time PCR using specific primers and Resolight® (DNA-binding fluorescent dye). Standard curves were generated using serial dilutions of cloned specific viral sequences. Accurate amplification and high efficiency was demonstrated in these reactions. Results: realtime PCR amplification did not show a persistent increase of viral counts in cultures during the 21-day follow-up. However, for vesicular stomatitis virus, a transient increase was observed at 7 and 14 days in both cell lines, but considered as not conclusive for viral presence. Conclusions: real time PCR analysis showed to be a suitable method for viral detection in fetal bovine serum samples and through this method no consistent viral or mycoplasma presence was detected in the MICROGEN® fetal bovine serum.

Objetivos: se empleó el método de PCR en tiempo real para detectar los virus patógenos bovinos: Adenovirus bovino (BAdV), virus de la diarrea Viral Bovina tipos 1 y 2 (BVDV-1 y BVDV-2), Virus Respiratorio Sincitial Bovino (BRSV), Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), Virus de la Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV-3), Herpesvirus Bovino-1 (BoHV-1) y Mycoplasma, en suero fetal bovino (FBS, MICROGEN ®)obtenido en Colombia, con el objetivo de incluir estos análisis en el control de calidad del FBS. Metodos: las líneas celulares MDBK de origen bovino y HEp-2 de origen humano se cultivaron con el FBS MICROGEN® por 21 días, tomando muestras de cultivos y sobrenadantes cada 7 días. Una ves extraido el DNA y RNA, a partir de este último se sintetizó cDNA, y en los dos tipos de muestras se analizó la presencia de los agentes patógenos mencionados por PCR en tiempo real empleando iniciadores específicos para cada uno y Resolight® (colorante fluorescente de unión a DNA). Se generaron curvas estándar con diluciones seriadas de secuencias virales específicas clonadas en plásmidos, que mostraron amplificación específica y altas eficiencias. Resultados: el análisis de los cultivos mantenidos con el FBS en estudio no mostró aumento del número de copias virales detectadas a lo largo del periodo de 21 días de seguimiento, excepto para el virus de la estomatitis vesicular, que mostró un incremento transitorio en los sobrenadantes de los cultivos de las dos líneas celulares a los 7 y 14 días de cultivo, que no se consideró concluyente para la presencia del virus. Conclusiones: el método de PCR en tiempo real mostró utilidad para la detección de virus patógenos y mycoplasma en FBS, y mediante este método no se obtuvieron resultados que permitan concluir que los patógenos virales o los mycoplasmas están presentes en los cultivos mantenidos con el suero fetal bovino MICROGEN®.

Objetivo: Foi utilizado o método de PCR em tempo real para detectar os vírus patogénicos bovinos: Adenovírus Bovino (BAdV), Vírus da Diarreia Viral (BVDV-1 e BVDV-2), Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV ), Vírus da Estomatite Vesicular (VSV), Vírus da Parainfluenza Bovina tipo 3 (BPIV- 3), Herpesvírus Bovino-1 (BoHV-1) e Mycoplasma, em soro fetal bovino (FBS, Microgen®) obtido na Colômbia, de modo a incluir esta análise no controle de qualidade FBS. Métodos: as linhas celulares de MDBK de origem bovina e HEp-2 de origem humana foram cultivadas com FBS Microgen® durante 21 dias, tomando amostras de cultura e sobrenadantes cada 7 dias. Uma vez retirado o DNA e RNA, foi sintetizado o cDNA a partir do RNA. Nos dois tipos de amostras foram analisadas para determinar a presença de patógenos mencionados por PCR em tempo real usando primers específicos para cada um e Resolight®(corante fluorescente de união à DNA). As curvas padrão foram geradas com diluições em série de sequências virais específicas, clonadas em Resultados: plasmídeos, que mostram amplificação específica e altas eficiências. a análise das culturas mantidas em FBS em estudo, não mostraram aumento no número de cópias virais detectadas ao longo do período de 21 dias de seguimento, exceto para o vírus da estomatite vesicular, que mostrou um aumento transitório nos sobrenadantes das culturas de duas linhas celulares aos 7 e 14 dias de cultura, que não foi considerado conclusivo para a presença do vírus. Conclusões: O método de PCR em tempo real foi útil para a detecção de vírus patogênicos e mycoplasma em FBS, e por este método foram obtidos resultados que demonstram que patógenos virais ou mycoplasmas estão presentes nas culturas mantidas com soro fetal bovino Microgen®.