Selección espermática en semen congelado/descongelado de equino: evaluación de las membranas plasmática, acrosomal y potencial de membrana mitocondrial / Sperm selection in frozen/thawed semen of equine: evaluation of plasma, acrosome membranes and mitochondrial membrane potential

Los procedimientos de criopreservación inducen cambios morfofuncionales en los espermatozoides. Es importante post descongelación espermática utilizar procedimientos de selección que permitan recuperar espermatozoides altamente funcionales. El objetivo del presente estudio fue comparar la eficiencia del Swim-up y Equipure® en la selección de espermatozoides funcionales en semen descongelado de equino. Semen de 4 potros reproductores Criollos Chilenos (A, B, C y D), fueron descongelados separadamente y procesados (n=15) por: I.- Swim-up (SU) y II.- Equipure® (EQ). Post descongelación se determinó por citometría de flujo la viabilidad e integridad de membrana plasmática (SYBR-14/PI), potencial de membrana mitocondrial (YDm; JC-1), integridad de la membrana acrosomal (FITC-PSA/PI). La motilidad progresiva (%) en dos animales fue más alta (P<0,05) por SU comparado con EQ: A (55,7±5,8% v/s 38,17±3,7%) y C (37,5±7% vs. 32±2,1%, respectivamente). La integridad de la membrana plasmática (%), tres animales presentaron diferencias (P<0,05), siendo más alta por SU en dos animales comparado con EQ (A: 54,3±1,7 vs. 36,7±1,9, C: 36,1±5,7 vs. 29,4±4,8 y D: 34,4±9,4 vs. 52,7±5,2; respectivamente), solamente un animal fue superior EQ. En el YDm (%), diferencias significativas (P<0,05) fueron detectadas en los cuatro animales, siendo más altos en SU comparado con EQ (A: 69,1±8,6% vs. 47,4±3,3%, B: 59,34±12,3% vs. 24,8±1,5%, C: 54,9±12,3% vs. 43,2±3,1% y D: 53,1±17,6% vs. 37,5±5,7%; respectivamente). Los resultados obtenidos en el presente estudio demostraron que los métodos de selección espermática Swim-up y Equipure® permiten recuperar espermatozoides de diferente calidad funcional en semen congelado-descongelado de equino, presentándose diferencias individuales entre los animales con respecto a los métodos. Se observó una tendencia del método Swim-up en seleccionar espermatozoides de equino descongelados con mayor calidad funcional comparado con Equipure®.

Freeze-thaw procedures induce structural and functional changes in sperm. It is important to use post thaw sperm selection procedures that can retrieve highly functional sperm. The aim of this study was to compare the efficiency of the Swim-up and Equipure® in the selection of functional sperm of thawed equine semen. Semen of four Chilean Criollo reproductive stallions (A, B , C and D) were frozen and thawed using a standard protocol and processed separately (n = 15) : I. Swim-up (SU) and II. Equipure® (EQ). Post sperm selection,was determined by flow cytometry. Viability and plasma membrane integrity (SYRB-14/PI), mitochondrial membrane potential (YDm, JC -1), acrosome membrane integrity (FITC-PSA/PI). Progressive motility (%) was higher (P<0.05) in two animals per SU compared with EQ, A (55.7±5.8% vs. 38.17±3.7%) and C (37.5±7.0% vs. 32±2.1%, respectively). The viability and integrity of the plasma membrane (%), three animals showed differences (P<0.05), being higher for SU in two animals compared with EQ (A: 54.3±1.7 vs. 36.7±1.9, C: 36.1±5.7 vs. 29.4±4.8 and D: 34.4±9.4 vs. 52.7±5.2, respectively), only one animal was higher EQ. In YDm (%), significant differences were detected (P<0.05) in all four animals, being higher in SU compared with EQ (A: 69.1±8.6% vs. 47.4±3.3% B: 59.34±12.3% vs. 24.8±1.5%, C: 54.9±12.3% vs. 43.2±3.1% and D: 53.1±17.6% vs. 37.5±5.7%, respectively). The results obtained in this study showed that sperm selection methods Swim-up and Equipure® can retrieve different functional sperm quality in frozen-thawed equine semen, and that individual differences were registered among animals with respect to methods. In the Swim-up method a tendency for selecting higher functional quality in thawed equine sperm was observed when compared to Equipure®.

Sperm ultrastructure of Mytella (Bivalvia) populations from distinct habitats along the northern coast of São Paulo State, Brazil

Ultrastructural analyses of bivalve spermatozoa are relevant in studies that aim to identify taxonomic traits for the purposes of discriminating species and conducting phylogenetic studies. In the present work, spermatozoa of mussel specimens of the genus Mytella, collected from two populations living in distinct habitats, were examined by electron microscopy. The objective was to identify sperm ultrastructural taxonomic traits that could be used to differentiate Mytella species. The specimens were from populations that live in intertidal zones on the southeast coast of Brazil, either buried in muddy-sand sediment or anchored to rocky substrates. The acrosomal vesicle was conical and long, the axial rod extended from the nucleus to the acrosome, the nucleus was an oblate spheroid with a condensed chromatin, the intermediate portion contained mitochondria encircling a pair of centrioles, and there was a single flagellum. The sperm was of a primitive type. The spermatozoon ultrastructure did not distinguish the specimens buried in muddy-sand sediment from those anchored to rocky substrates. The data suggest that the specimens analyzed, despite living in distinct habitats, belong to the same species, which conchological analyses identified as M. charruana. The presence of an axial rod in their sperm cells supports the inclusion of M. charruana in the subfamily Mytilinae.

Sperm ultrastructure and spermatogenesis in the lizard, Tropidurus itambere

Spermatogenesis, with emphasis on spermiogenesis, is described for the lizard, Tropidurus itambere, using light microscopy, phase contrast and epifluorescence, as well as scanning and transmission electron microscopy. Cellular differentiation involves events of chromatin condensation, nuclear elongation and the formation of structural complexes, such as the acrosomal and axonemal ones. Other new characteristics, exclusive for this species, include various aspects of the subacrosomal granule, the insertion of the pro-acrosomal vesicle and the development of these structures to participate in the acrosomal complex. Radial projections occurjust above the nuclear shoulders, which have been recognized already from the beginning of cellular elongation. The development of the midpiece, the dense bodies, formation of the flagellum and elimination of residual cytoplasm result in the final characterization of the mature spermatozoon. Comparisons between Tropiduridae and other lizard families are made.

Morphological study of the spermatogenesis in the teleost Piaractus mesopotamicus

The spermatogenesis of Piaractus mesopotamicus was investigated under light and transmission electron microscopy. The specimens were captured from their natural environment (Rio Miranda and Rio Aquidauana, Pantanal Matogrossense, Brazil) during April and September. The results were compared with the spermatogenic data of specimens under captivity condition. In both conditions, P. mesopotamicus presented the typical spermatogenesis pattern of the teleost fishes, showing no significative differences. The spermatozoon was classified as type I, which has a globular head without acrosome, a short middle piece and a long tail constituted only by the flagellum. This type of spermatozoon is considered the basic type in fishes.

Efecto protector de la albúmina sobre las membranas del espermatozoide humano en la capacitación espermática in vitro / Albumin protective effect on human spermatozoa membranes during in vitro sperm capacitation

Se estudió el efecto de la preparación in vitro de semen sobre la estructura y sobrevida del espermatozoide humano, con el objeto de valuar si la albúmina protege las membranas durante la centrifugación. Se analizaron de manera cegada y aleatoria 12 muestras seminales de hombres fértiles a las cuales se les trató por tres métodos diferentes (swim-up, gradientes de albúmina, gradientes de percoll), para separar la fracción móvil de espermatozoides. Las membranas plasmática y acrosomal externa y la sustancia acrosomal de los espermatozoides fueron observadas al microscopio electrónico de transmisión en 50 espermatozoides por muestra y la viabilidad y movilidad progresiva se analizó después de incubación durante 24 horas a 37ºC. Se presenta evidencia que sugiere que la albúmina estabiliza la membrana acrosomal externa del espermatozoide humano e incrementa la viabilidad de esta célula

Immunodetection of acrosin during the acrosome reaction of hamster, guinea-pig and human spermatozoa

Mammalian sperm acrosomes contain a trypsin-like protease called acrosin which causes limited and specific hydrolysis of the extracellular matrix of the mammalian egg, the zona pellucida. Acrosin was localized on hamster, guinea-pig and human sperm using monoclonal and polyclonal antibodies to human acrosin labelled with colloidal gold. This was visualized directly with transmission electron microscopy, and with light and scanning microscopy after silver enhancement of the colloidal gold probe. Four distinct labelling patterns were found during capacitation and the acrosome reaction in hamster and guinea-pig spermatozoa, and three patterns were found in human spermatozoa. In the hamster, acrosin was not detected on the inner acrosomal surface after the completion of the acrosome reaction, thus correlating with the observation that hamster spermatozoa lose the ability to penetrate the zona after the acrosome reaction. With guinea-pig and human spermatozoa, acrosin was still detected after the completion of the acrosome reaction, thus correlating with the observation that acrosome reacted guinea-pig spermatozoa bind to and penetrate the zona pellucida

Effect of TEST-yolk upon sperm acrosome reaction

Espermatozoides humanos mantenidos en el buffer Test-yolk muestran un aumento de la frecuencia de fusión con los oocitos desnudos de hamster cuando se los compara con los espermatozoides recién eyaculados. Por consiguiente, en este trabajo, hemos estudiado la cinética de la reacción acrosomal y fertilización mediante el empleo de espermatozides humanos recíen obtenidos versus espermatozoides mantenidos en el Test-yolk. En esta forma procuramos determinar si la frecuencia de fertilización estaba relacionada a la de la reacción acrosomal. Las muestras de sememn fueron divididas en dos alicuotas, una fresca (control) y la otra mantenida por 48 horas a 4-C en el buffer Test-yolk (experimental). Los espermatozoides de cada muestra fueron examinados cada dos horas para: a) evaluar la incidencia de la reacción acrosomal estudiada con el microscopio electrónico de barrido y b) la habilidad para fusionarse con oocitos denudados de hamster. Los resultados mostraron que, en función del tiempo de incubación, ocurre un aumento en el procentaje de reacción acrosomal en ambos grupos, control (cero a 28.3%) y el experimental (5 a 27.8%). Se encontró también que la incidencia de la reacción acrosomal no presenta diferencias significativas en ambos grupos. Con respecto al porcentaje de fertilización el grupo experimental mostró valores más altos (p < 0.05) cuando se lo comparó al grupo control. Estos reusltados sugieren que el aumento del porcentaje de fertilización de los espermatozoides mantenidos en le Test-yolk no está asociado a un aumento de la reacción acrosomal sino probablemente a una mejor eficiencia en la fusión de las membranas de las gametas

Capacitación y reacción acrosómica: breve descripción / Capacitation and acrosome reaction: brief description

Se analizan las principales características biofísicas y bioquimícas de los fenómenos de capacitación y reacción acrosómica espermática. Se citan los resultados más recientes obtenidos al estudiar estos fenómenos en animales de experimentación y en el hombre. Además, e menciona las técnicas de laboratorio más modernas para las investigaciones clínicas y según nuestra experiencia, se recomienda la utilización del cambio cualitativo de movilidad post incubación in vitro para el estudio de la capacitación y la triple coloración de Talbot para el análisis de la reacción acrosómica, ambas con fines diagnosticos

In vitro capacitation of goat spermatozoa.

Goat epididymal and ejaculated spermatozoa were incubated in Krebs-Ringer bicarbonate buffer containing pyruvate and lactate as energy source. A 3 hr incubation for epididymal and 4 hr for ejaculated spermatozoa was required for the capacitation and acrosome reaction to take place. Calcium is an essential requirement which was needed for motility maintenance/activation and for the initiation of acrosome reaction. A 2-fold increase in cAMP content was measured over 3 hr period of incubation of goat epididymal spermatozoa which was not seen when calcium ions were either omitted or chelated with EGTA. There is thus a definite involvement of Ca2+ ions and cAMP in capacitation and acrosome reaction of goat spermatozoa.

In vitro capacitation of spermatozoa in different strains of mice: the acrosome reaction

La reacción acrosómica normal se midió como parámetro indirecto para determinar la capacitación in vitro de espermatozoides en diferentes cepas de ratones. Se utilizaron tres cepas: FI (BALB/c x C57BL/6J-bg). C57BL/6J-bg y C57BL/6J-small. Se hallaron diferencias significativas entre las tres cepas (p<0,05). Se realizó la fertilización in vitro utilizando una concentración de espermatozoides relativamente baja (10 espermatozoide/ml), a fin de averiguar si las diferencias en el porcentaje de espermatozoides que han sufrido reacción acrosómica a los 120min de incubación se correlaciona con las diferencias en las tasas de fertilidad. Se encontraron diferencias en la fertilización (p<0,05), pero sólo en algunas cepas ésto podría ser debido a diferencias en el porcentaje de espermatozoides sin acrosomas (capacitación). Cuando la concentración de espermatozoides fue aumentada a 10 espermatozoide/ml, las diferencias desaparecieron (p>0,05). No se detectaron diferencias entre las cepas utilizadas con respecto a la motilidad o hiperactividad después de la capacitación. La misma cinética de reacción acrosómica se halló en las cepas C57BL/6J-bg y C57BL/6J-small, pero fue diferente en el híbrido. También se observó un alto número (4%) (p<0,05) de espermatozoides morfológicamente anormales en las cepas endocriadas, con respecto a la híbrida (1%)