Seleção de aptâmeros que se ligam ao receptor humano para o gosto doce / Screening for aptamers that bind to the human sweet taste receptor (hT1R2/hT1R3)

Foi demonstrado que o gosto doce é transduzido por receptores acoplados a proteína G classe III (GPCRs), T1R2 e T1R3. Essas proteínas exibem longas extremidades amino-terminais que formam um domínio de ligação globular extracelular. Elas são expressas em células associadas ao gosto (células epiteliais que constituem os botões gustativos nas papilas gustativas), que respondem a moléculas associadas ao gosto doce. Quando T1R2 e T1R3 são co-expressas em células heterólogas, elas respondem, como heterômeros, a uma série de açúcares, alguns D-aminoácidos, edulcorantes artificiais e proteínas doces. Foi também demonstrado que o receptor humano T1R2/T1R3 para o gosto doce apresenta múltiplos sítios de ligação. Para melhor compreender a estrutura desse receptor e responder à pergunta de como um único quimiorreceptor pode ser responsivo a uma variedade de ligantes, foi utilizada a abordagem denominada evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) para isolar, a partir de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos, aptâmeros de RNA resistentes a nuclease que se ligam ao receptor humano para o gosto doce com alta afinidade. Após um enriquecimento de doze ciclos do pool original de RNA contendo em torno de 1013 sequências diferentes (contra preparações de membrana de células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3) e outros ciclos de contrasseleção negativa (para eliminar moléculas de RNA que se ligam de forma inespecífica à membrana de nitrocelulose e a outras proteínas diferentes do alvo, ou seja, proteínas de membrana de células HEK293T selvagem), realizou-se a transcrição reversa do RNA seguida de amplificação por PCR e sequenciamento. Aptâmeros do ciclo 12 com sequências consenso foram selecionados, e a ligação de alguns deles com hT1R2/hT1R3 foi então avaliada. Cinco desses aptâmeros mostram claramente uma maior afinidade por células HEK293T que expressam hT1R2/hT1R3. Como segunda parte desta tese, estudamos outro receptor, denominado CD36, que, como o receptor T1R2/T1R3, é expresso na língua. Estudos indicam que ele age como receptor gustativo de gordura. Neste trabalho, verificamos que essa proteína é expressa em uma subpopulação de neurônios olfatórios presentes no epitélio olfatório, indicando que ela pode ter também uma função olfatória, ainda não caracterizada

It has been shown that sweet taste is transduced by the Class III G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) T1R2 and T1R3, which show long N-termini that form a globular extracellular ligand-binding domain. These receptors are expressed in the taste cells (epithelial cells that constitute the taste buds in taste papillae) that respond to sweet tastants, and when T1R2 and T1R3 are coexpressed in heterologous cells, they respond, as heteromers, to a series of sugars, some D-amino acids, artificial sweeteners and sweet proteins. It has also been demonstrated that the sweet taste receptor has multiple binding sites. In order to better understand the structure of this receptor and answer the question of how a single chemoreceptor can respond to a variety of ligands, we used the combinatorial oligonucleotide library screening approach, denominated Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX), to isolate nuclease-resistant RNA aptamers that bind to the human sweet taste receptor with high affinity. Following a twelve round enrichment of the previous random RNA pool containing around 1013 different sequences (against membrane preparations of hT1R2/hT1R3-expressing HEK293T cells) and negative counterselection cycles (to eliminate RNA molecules that bind nonspecifically to the nitrocellulose membrane and to proteins other than the target, that is, HEK293T cells membrane proteins), the RNA was reverse-transcribed for DNA sequencing. Aptamers from cycle 12 with consensus sequences were selected, and the binding of some of them to the human sweet taste receptor was then evaluated. Five out of the aptamers clearly show greater affinity for hT1R2/hT1R3-expressing HEK293T cells than for hT1R2/hT1R3-non-expressing HEK293T cells. In this thesis we have also analyzed another receptor, denominated CD36, which is also expressed in the tongue. Studies indicate that it acts as a receptor for fat. In this work, we found that CD36 is expressed in a subset of the olfactory neurons localized in the olfactory epithelium, indicating that it may also have an as yet uncharacterized olfactory function

Purificação de células troco de lipoaspirado humano por aptâmeros de DNA, seguida da caracterização dos fenótipos obtidos da diferenciação neuronal / Human adipose mesechymal stem cell separation by DNA aptamers followed by the characterization of the obtained phenotypes from neuronal differentiation

Células tronco mesenquimais de tecido adiposo, são uma promissora ferramenta para aplicações clínicas em terapias celular e regenerativa, em vista da facilidade de sua extração e da maior quantidade de células por unidade de massa de tecido quando comparado a outras fontes clássicas de células mesenquimais como medula óssea. O protocolo clássico de extração e purificação dessas células, depende de sua adesão em plástico e xeno-materiais demandando muito tempo para ser utilizado por médicos para auxiliar pacientes em procedimentos de emergência. Estas células são capazes se diferenciar em diversos tipos celulares, o que as torna boas candidatas para terapia celular, embora sua capacidade de transdiferenciação para fenótipos neuronais seja ainda discutida. Neste trabalho demonstramos um novo processo para isolar essas células na base de epitopos específicos expressos (assinatura molecular de superfície) utilizando aptâmeros como ligantes de alta afinidade para estes sitios. Aptâmeros, moléculas de DNA simples fita identificadas a partir de uma biblioteca combinatória de sequencias de DNA simples-fita foram identificados por ciclos reiterativos de seleção in vitro (SELEX) utilizando células tronco do lipoaspirado como alvo. Dois aptâmeros isolados, denominados APT9 e APT11, foram capazes de identificar subpopulações (15,8 e 23,7% respectivamente) dentre as células tronco mesenquimais (classicamente CD29+/CD90+/CD45-) e separá-las usando nano-partículas magnéticas acopladas aos aptâmeros. Além disso, seguindo uma indução para diferenciação neuronal, as células tronco mesenquimais passam a apresentar morfologia neuronal e apresentam expressão e atividade de diversos receptores de neurotransmissores, avaliados por PCR real-time e imageamento de variações da concentração de cálcio intracelular ápos stimulação com vários agonistas de receptores metatrópicos e ionotrópicos. Ao longo da diferenciação, os níveis transcricionais de mRNA de receptores de cininas (B1 e B2), nicotínicos (alfa 7), muscarínicos (M1, M3 e M4), glutamatérgicos (AMPA2 e mGluR2), purinérgicos (P2Y1 e P2Y4) e GABAergicos (GABA-A, subunidade 3) e da óxido nítrico sintase neural aumentaram quando comparados aos níveis das células não diferenciadas, enquanto que os níveis de expressão de outros receptores incluindo purinérgicos P2X1, P3X4, P2X7 e P2Y6 e muscarínico M5 diminuíram. Os níveis de atividade das classes dos receptores estudados, por imageamento de variações da concentração de cálcio intrac, aumentaram para a maioria dos agonistas analisados durante a diferenciação neuronal com exceção para respostas induzidas por glutamato e NMDA. Células diferenciadas expressavam altos níveis de antígenos específicos de neurônios como ß3-tubulina, NF-H, NeuN e MAP-2 indicando uma diferenciação em fenótipo neuronal bem sucedida. Desta maneira, esta tese, ao identificar aptâmeros, prove uma inovadora solução para médicos usarem as células tronco mesenquimais dentro de uma sala de cirurgia, através de um método que é capaz de purificar essas células em um tempo clínico viável, com pureza e sem contato com contaminantes. Além disso, nós mostramos aqui que com um protocolo como o proposto para diferenciação neuronal, nós poderíamos induzir essas células para se diferenciar em neurônios, através da ativação de fatores de transcrição específicos, levando às células tronco mesenquimais a serem possivelmente utilizadas em terapias celulares de reparo neuronal

Adipose mesenchymal stem cells are promising tools for clinical applications in cellular and regeneration therapies, in view of easiness of extraction and higher amount of isolated stem cells per mass of tissue when compared to other classical mesenchymal stem cell sources including bone marrow. The classical protocol to extract and purify these cells, depending on plastic adherence and xeno-materials, is too time consuming to be used by physicians to help patients at emergency procedures. These cells are able to differentiate into various cell types, making them good candidates for cell therapy, however their capability for transdifferentiation into neural phenotypes is yet discussed. Here we show a novel process to isolate these cells using their surface molecular signature and aptamers, ssDNA molecules identified through the SELEX technique, denominated APT9 and APT11 that are able to identify subpopulations (15,8 and 23,7% respectively) within the mesenchymal stem cells (classically CD29+/CD90+/CD45-) and separate them using magnetic nano-particles attached to the aptamers. Moreover, following induction to neural differentiation, mesenchymal cells presents neuronal morphology and present expression and activity of several neurotransmitter receptors, as evaluated by real-time PCR and calcium imaging. During this process, mRNA transcription levels of bradykinin (B1 and B2), cholinergic (alpha 7), muscarinic (M1, M3 and M4), glutamatergic (AMPA2 and mGlu2), purinergic (P2Y1 and P2Y4) and GABAergic (GABA-A, subunit 3) receptors and neuronal nitric oxide synthase were augmented when compared to levels of undifferentiated cells, while the expression levels of other receptors including purinergic P2X1, P2X4, P2X7 and P2Y6 and muscarinic M5 receptors were down-regulated. Activity levels of the studied receptor classes, as studied by calcium imaging, increased for most of the agonists analyzed during the neuronal differentiation with the exception for glutamate- and NMDA-induced receptor responses. Differentiated cells expressed high levels of neuron-specific antigens such as ß3-tubulin, NF-H, NeuN and MAP-2, indicating a successful differentiation into neuronal phenotypes. This thesis, by identifying aptamers, provides a novel solution for physicians to use mesenchymal stem cells inside a surgery room, by using a method that are able to purify the cells in a clinical viable time, with purity and no contact with contaminats. Furthermore, we show here that with a protocol as provided for neuronal differentiation, we could induce these cells to differentiate into neurons, by activating specific transcription factors,making mesenchymal stem cells to possibly be used in neuronal repair cell therapies