RESUMO
Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global do fungo aquático Blastocladiella emersonii submetido ao estresse de carência de oxigênio (hipóxia), utilizando a técnica de microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3773 genes distintos. Nos experimentos de hipóxia gradual (diminuição gradual da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) e hipóxia direta (diminuição direta da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) observamos que 650 genes foram diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições de estresse e que 534 deles mostraram-se afetados (direta ou indiretamente) pela disponibilidade de oxigênio, uma vez que apresentaram recuperação (ou tendência à recuperação) da sua expressão aos níveis normais, quando as células foram reoxigenadas. Além de modular a expressão de diversos genes sem função conhecida, B. emersonii responde à hipóxia reajustando a expressão de genes responsáveis pela produção e consumo de energia. Pelo menos transcricionalmente, este fungo favorece o metabolismo anaeróbico, através da indução de genes que codificam enzimas da via glicolítica e lactato desidrogenase, ao passo que no ciclo do ácido cítrico, a maioria dos genes encontram-se reprimidos ou não sofrem alteração na expressão. Processos dispendiosos em energia como síntese protéica, metabolismo de aminoácidos, enovelamento de proteínas e transporte por membrana apresentaram perfis predominantemente de repressão gênica quando em carência de oxigênio. Ainda utilizando a técnica de microarranjos, mostramos semelhanças entre os perfis transcricionais nos experimentos hipóxia e de carência de Fe2+ (tratamento com quelante de Fe2+ 2,2´-dipyridyl) sugerem que estes estresses estão de alguma forma relacionados, fornecendo bons indícios de que o íon Fe2+ possa ter um papel importante no mecanismo sensor de oxigênio e/ou de resposta a hipóxia em B. emersonii. Além disso, o tratamento prévio de células...
In this work we analyzed global gene expression changes in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii submitted to oxygen deprivation (hypoxia), using cDNA microarrays containing 3,773 distinct genes. In gradual hypoxia (gradual decrease in dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) and direct hypoxia (direct decrease of dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) we observed 650 differentially expressed genes in at least one of the stress conditions tested, 534 of them being affected (directly or indirectly) by oxygen availability, since they showed recovery of normal expression levels or a tendency to recover, when cells were reoxygenated. Besides modulating many genes with no previously assigned function, B. emersonii responds to hypoxia by readjusting the expression levels of genes responsible for energy production and consumption. At least transcriptionally, this fungus seems to favour anaerobic metabolism through the induction of genes encoding glycolytic enzymes and lactate dehydrogenase, while in the TCA-cycle, most genes were repressed or unchanged. Energy-costly processes like protein synthesis, amino acid metabolism, protein folding and transport had their gene expression profiles predominantly repressed during oxygen deprivation. Microarray experiments also showed similarities between the transcriptional profile of genes in hypoxia and iron (II) deprivation (treatment with the iron (II) chelator 2,2/'-dipyridyl), suggesting that these stresses are somehow related, giving good evidence that Fe2+ ion could have a role in the mechanism of oxygen sensing and/or response to hypoxia in B. emersonii. Furthermore, pretreatment of cells subjected to hypoxia with the antibiotic geldanamycin, a known inhibitor of the heat shock protein HSP90, caused a significant decrease in the induction of certain hypoxic genes, indicating that this fungus could have a mechanism similar to that of the mammalian hypoxia transcription factor...
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Blastocladiella/genética , Fungos Aquáticos/métodos , Expressão Gênica , Oxigênio , Bioquímica , Biologia Molecular/métodos , DNA Fúngico/química , HipóxiaRESUMO
SpotWhatR is a user-friendly microarray data analysis tool that runs under a widely and freely available R statistical language (http://www.r-project.org) for Windows and Linux operational systems. The aim of SpotWhatR is to help the researcher to analyze microarray data by providing basic tools for data visualization, normalization, determination of differentially expressed genes, summarization by Gene Ontology terms, and clustering analysis. SpotWhatR allows researchers who are not familiar with computational programming to choose the most suitable analysis for their microarray dataset. Along with well-known procedures used in microarray data analysis, we have introduced a stand-alone implementation of the HTself method, especially designed to find differentially expressed genes in low-replication contexts. This approach is more compatible with our local reality than the usual statistical methods. We provide several examples derived from the Blastocladiella emersonii and Xylella fastidiosa Microarray Projects. SpotWhatR is freely available at http://blasto.iq.usp.br/~tkoide/SpotWhatR, in English and Portuguese versions. In addition, the user can choose between [quot ]single experiment[quot ] and [quot ]batch processing[quot ] versions.
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Humanos , Análise de Sequência com Séries de Oligonucleotídeos/instrumentação , Blastocladiella/genética , Perfilação da Expressão Gênica , Software , Xylella/genética , Análise por Conglomerados , Gráficos por Computador , Interface Usuário-ComputadorRESUMO
Foi realizado um programa de seqüenciamento de cDNAs obtidos de bibliotecas da fase de germinação do fungo aquático Blastocladiella emersonii. Os dados gerados, em conjunto com o projeto de seqüenciamento de cDNAs da fase de esporulação do fungo, permitiram a descoberta de aproximadamente 4.900 genes diferentes de B. emersonii (Ribichich et al., 2005). Os genes putativos foram anotados e associados com as categorias funcionais descritas pelo Gene Ontology Consortium e encontram-se na base de dados http://www.blasto.iq.usp.br. O perfil de expressão dos genes foi avaliado por Northern digital e vários transcritos apresentaram perfil de expressão regulado durante a germinação...
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Blastocladiella , Expressão Gênica/genética , Fungos , Análise de Sequência de DNA , Northern Blotting , Meios de Cultura , Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase ReversaRESUMO
A proteína de choque térmico Hsp90 é uma chaperone molecular encontrada no citosol. O cDNA imcompleto desta proteína foi isolado de uma biblioteca construída a partir de mRNA de células de esporulação de B. emersonii submitidas a choque térmico. Um clone genômico contendo a seqüência completa do gene hsp90 também foi isolado, seqüênciado e caracterizado. A região codificadora do gene hsp90 é interrompida por um único íntron de 184 nucleotídeos. A seqüência de aminoácidos deduzida indicou uma proteína de 710 resíduos, com massa molecular calculada de 80.792 Da e um pl médio de 4,85. Experimentos de extensão de oligonucleotídeo e RACE-PCR demonstraram um sítio único de início de transcrição localizado...
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Blastocladiella , Chaperonina 10 , Chaperonina 60 , Técnicas In Vitro , Proteínas de Choque Térmico HSP90/biossíntese , RNA Mensageiro , Vetores Genéticos/biossíntese , Análise de Sequência com Séries de Oligonucleotídeos , Northern Blotting , Western Blotting , Reação em Cadeia da Polimerase/métodosRESUMO
Aquatic fungi from four brackish water lakes; Edku, Burullus and Manzala lakes which are located at the northern region of Egypt and Qarun lake that located in El-Fayoum city are reported in this manuscript. Twenty-nine fungal species which belong to 19 genera of aquatic fungi were recovered from water samples collected from the studied lakes. The most frequently isolated fungal species were Chytridium conferrop, Allomyces throughout and Rhizoclosmatium globosum. Thraustochytrium amoeboidum and Leptolegniella exoosporus have a moderately occurrence frequency. The maximum fungal count of recovered aquatic fungi was recorded in Burrullus lake followed by EdKu, Manzala and Qarun lakes. This study was extended to test the ability of six selected aquatic fungi (Brevilegniella keratinophila, Blastocladiella cystogena, Chytridium conferrop, Entophlyctis variabilis, Schizochytrium mangrovei and Thraustochytrium rosii), to uptake the radionuclide from their culture medium as a step to biologically treat the waste water or solution with radio-cesium and radio-cobalt. Fifty seven % of Cs-137 and 35% of Co-60 could be removed from liquid waste by the selected aquatic fungi.
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Allomyces , Blastocladiella , Contagem de Colônia Microbiana , Egito , Fungos , Lagos , Resíduos Radioativos , Águas Residuárias , ÁguaRESUMO
O único gene para Calmodulina (CaM) e o cDNA correspondente do quitridiomiceto Blastocladiella emersonii foram isolados e caracterizados. O gene CaM é interrompido por três introns e transcrito como uma única espécie de mRNA de 0,7 kb, codificando uma proteína 91 por cento idêntica à CaM humana. A Calmodulina de B. emersonii foi expressa em Escherichia coli como uma proteína de fusão com Glutationa-S-transferase (GST), purificada por cromatografia de afinidade e clivada da porção GST usando uma protease sítio específico. na presença de `Ca²+ï, a CaM de B. emersonii exibiu uma alteração na mobilidade eletroforética semelhante à CaM bovina e foi capaz de ativar a autofosforilação da proteína quinase dependente de `Ca²+ï-CaM (CaMKII) de cérebro de rato...
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Anticorpos Antibacterianos , Blastocladiella , Calmodulina/isolamento & purificação , Clonagem Molecular , DNA Complementar , Escherichia coli/imunologia , Oligonucleotídeos , Northern Blotting , Cromatografia de Afinidade , Meios de Cultura , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Eletroforese em Gel de Ágar/métodosRESUMO
Preference for specific protein substrates together with differential sensitivity to activators and inhibitors has allowed classification of serine/threonine protein phosphatases (PPs) into four major types designated types 1, 2A, 2B and 2C (PP1, PP2A, PP2B and PP2C, respectively). Comparison of sequences within their catalytic domains has indicated that PP1, PP2A and PP2B are members of the same gene family named PPP. On the other hand, the type 2C enzyme does not share sequence homology with the PPP members and thus represents another gene family, known as PPM. In this report we briefly summarize some of our studies about the role of serine/threonine phosphatases in growth and differentiation of three different eukaryotic models: Blastocladiella emersonii, Neurospora crassa and Dictyostelium discoideum. Our observations suggest that PP2C is the major phosphatase responsible for dephosphorylation of amidotransferase, an enzyme that controls cell wall synthesis during Blastocladiella emersonii zoospore germination. We also report the existence of a novel acid- and thermo-stable protein purified from Neurospora crassa mycelia, which specifically inhibits the PP1 activity of this fungus and mammals. Finally, we comment on our recent results demonstrating that Dictyostelium discoideum expresses a gene that codes for PP1, although this activity has never been demonstrated biochemically in this organism
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Blastocladiella/enzimologia , Dictyostelium/enzimologia , Células Eucarióticas/enzimologia , Neurospora crassa/enzimologia , Fosfotreonina/metabolismo , Germinação/fisiologia , Especificidade por SubstratoRESUMO
A new species of fungus belonging to the lethal genus Coelomomyces, C. neotropicus, is described and illustrated. It was found parasitizing larvae of two species of Culicidae, Culex pilosus and Aedes sp., in a lowland tropical wet forest swamp in northeast Costa Rica.