Evaluation of Dunaliella salina growth and corresponding ß-carotene production in tubular photobioreactor / Avaliação do crescimento da Dunaliella salina e correspondente produção de ß-caroteno em fotobiorreator tubula

Microalgae, photosynthetic microorganisms, are rich in lipids, polyunsaturated fatty acids, carbohydrates, proteins, vitamins, as well as carotenoids, which are antioxidants that may protect human body from various diseases including obesity, cardiovascular disease, vision-related diseases such as macular degeneration and certain types of cancer. These natural pigments have applications in the pharmaceutical (nutraceutical), food (coloring, functional food, and supplements), and cosmetics industries (e.g. sunscreen), as well as in aquaculture (animal feed). The Dunaliella salina microalga can synthesize 10% of dry weight in ß-carotene (orange pigment, pro-vitamin A activity) under high light intensity and nitrogen and phosphorus limitation, among other stress conditions. The first chapter of this thesis presents a review focused on microalgae carotenoids: culture systems, mode of operation, and applications. In this bibliographic survey, the advantages of microalgae cultivation in relation to traditional sources (higher plants) were discussed, as well as a discussion of the main cultivation systems and their importance in cell growth. This review presented a critical analysis of the different operational regimes like batch, fed-batch, semi-continuous and continuous. Relevant information on the most important world producers of microalgae carotenoids were presented. Chapter II presents the development of a modified method of dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) for rapid extraction of ß-carotene from Dunaliella salina cultivated in tubular photobioreactor, with subsequent development of a rapid chromatographic screening method using a C4 column for separation of geometric isomer of ß-carotene. The use of benzene as extraction solvent and water with 50% acetone as dispersant provided the best condition for the extraction of this carotenoid. In HPLC (High Performance Liquid Chromatography), employing mobile phase composed of methanol and water (95:5, v/v), it was possible to detect/quantify ß-carotene at 14 min (retention time). Besides the short analysis time (<20 min), by the miniaturized extraction (< 10 mL organic waste) this method abide by green chemistry analytical principles. It is known that nitrogen, phosphorus, as well as carbon and vitamins are vital elements for the growth of microalgae, also determining the biochemical composition of biomass. In this sense, Chapter III presents the study of the influence of different amounts of sodium nitrate (1N = 75 mg L-1; 1.5N = 112.5 mg L-1, and 3N = 225 mg L-1) and phosphate monobasic dehydrate (1P = 5.65 mg L-1, 1.5P = 8.47 mg L-1, and 3P = 16.95 mg L-1) in seawater-based f/2 medium on the growth of Dunaliella salina and ß-carotene biosynthesis, by continuous process with different replenishment proportions (R = 20% and 80%). Best results of cell productivity were obtained by semicontinuous process (mean values of Px up to 6.7 x 104 cells mL-1 d-1 with medium 1N:1P; R =20%) in comparison with batch process cultivation. Maximum cell density (Xm) obtained in this work was not dependent of R, but the best results were obtained when using medium 1.5N:1.5P (mean values up to 5.6 x 105 cells mL-1 with R =80%) instead of 1N:1P. The content of ß-carotene in the cells, in general, was higher in cells grown in medium 1N:1P (mean yield values up to 57.5 mg g-1 with R =80%) in comparison with medium 1.5N:1.5P. The cultivation of D. salina with media 3N:3P led to a long lag phase, followed by decrease in cell density and cell lysis. The use of a tubular photobioreactor contributed to successfully cultivate this microalga without contamination by protozoa. The cultivation of Dunaliella salina in tubular photobioreactor with the use of 12:12 photoperiod was appropriate, as well as to induce carotenogenesis, in the second stage, by increasing the light intensity and absence of pH control

As microalgas, micro-organismos fotossintetizantes, são ricas em lipídios, ácidos graxos poli-insaturados, carboidratos, proteínas, vitaminas, além de carotenoides que são antioxidantes com potencial de proteger o organismo humano de várias doenças incluindo a obesidade, doenças cardiovasculares, doenças relacionadas à visão como a degeneração macular e certos tipos de câncer, entre outras. Esses pigmentos naturais têm aplicações em indústrias farmacêuticas (nutracêuticos), alimentícias (colorantes, alimentos funcionais e suplementos) e de cosméticos (exemplo: filtro solar) e na aquacultura (ração animal). A microalga Dunaliella salina é capaz de sintetizar, sob alta intensidade luminosa e limitação de nutrientes como fontes de fósforo e nitrogênio, dentre outras condições de estresse, 10 % do peso seco em ß-caroteno (pigmento laranja com atividade pró-vitamina A). Assim, neste trabalho, numa primeira etapa, foi feita uma revisão da literatura abordando a produção de carotenoides por microalgas, bem como sua aplicação. Nesse levantamento bibliográfico abordou-se, dentre outros assuntos, as vantagens do cultivo de microalgas em relação as fontes tradicionais (plantas superiores), assim como uma discussão dos diferentes sistemas de cultivos e sua importância no crescimento celular. Esse review apresentou uma análise crítica dos principais regimes operacionais como batch, fed-batch, semicontínuo e contínuo. Apresentou-se também informações relevantes sobre os mais importantes produtores mundiais de carotenoides de microalgas. Numa segunda etapa, foi desenvolvido um método modificado de microextração líquido-líquido dispersivo modificado (DLLME) para a rápida extração de ß-caroteno de Dunaliella salina cultivada em fotobiorreatores tubulares, com subsequente desenvolvimento de método cromatográfico em uma coluna C4 para a separação do isômero geométrico de ß-caroteno. A extração ótima de ß-caroteno foi obtida com benzeno como solvente extrator e água com 50% de acetona como dispersante. Empregando uma fase móvel composta por metanol e água (95:5, v/v) em HPLC, foi possível a detecção/quantificação de ß-caroteno com 14 minutos de tempo de retenção. Além dos tempos curtos de análises (<20 min), pela extração em volume reduzido (< 10 mL resíduos orgânicos) este método obedece aos princípios da química verde. Sabe-se que nitrogênio, fósforo, assim como carbono e vitaminas são elementos vitais para o crescimento das microalgas e também exercem influência na composição bioquímica da biomassa. Assim, na terceira etapa deste trabalho, estudou-se a influência das quantidades de nitrato de sódio (75 mg L-1, denominado 1N; 112,5 mg L-1, denominado 1,5N; 225 mg L-1, denominado 3N) e de fosfato monobásico dihidratado (5,65 mg L-1, denominado 1P; 8,47 mg L-1, denominado 1,5P; 16,95 mg L-1, denominado 3P) em meio f/2, que tem como base a água do mar, no crescimento e na síntese de ß-caroteno da Dunaliella salina por processo semicontínuo, com uso de frações de corte (R) de 20% e 80%. Foram obtidas produtividades celulares mais elevadas em processos semicontínuos do que em processo descontínuo, com produtividades médias de até 6,7 x 104 células mL-1 d-1 (meio 1N:1P; R =20%). A máxima concentração celular (Xm) obtida neste trabalho não foi dependente de R. Os melhores resultados de Xm foram obtidos quando se usou meio 1,5N:1,5P em vez de meio, com 1N:1P, com valores médios de até 5,6 x 105 células m L-1 (R =80%). O conteúdo de ß-caroteno nas células, de maneira geral, foi maior nas células cultivadas em meio 1N:1P do que no meio 1,5N:1,5P, com valores até 57,5 mg g-1 (R =80%). O cultivo de D. salina com o meio 3N:3P levou a uma longa fase lag, seguida por uma diminuição na concentração celular e sua lise. O cultivo de células em um fotobiorreator tubular contribuiu para um crescimento celular sem contaminação por protozoários. O cultivo de Dunaliella salina em fotobiorreator tubular com o uso de fotoperíodo 12:12 foi apropriado, assim como induzir a carotenogênese, no segundo estágio, por meio do aumento da intensidade luminosa e ausência de controle de pH

Calogênese em Cissus sicyoides L. a partir de segmentos foliares visando à produção de metabólitos in vitro / Calluses from Cissus sicyoides L. leaves

Os metabólitos secundários são essencialmente produzidos e extraídos a partir de plantas cultivadas no campo sobre a influência de variações sazonais. A utilização de técnicas biotecnológicas apresenta-se como um recurso alternativo para a produção de fármacos. Dentre essas técnicas, destaca-se a cultura de tecidos através da calogênese, uma vez que o crescimento de calos é desejável para induzir variação somaclonal e estudos fisiológicos, principalmente quando se deseja relacionar a presença de metabólitos secundários com o crescimento celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de calogênese de Cissus sicyoides L., a partir de segmentos foliares visando à produção de metabólitos in vitro. Para o estabelecimento in vitro, foram utilizados como explantes, segmentos foliares retirados de planta adulta cultivada em campo. Após desinfestação, o material foi inoculado em meio MT + 1,0 mg L-1 ANA e mantido em câmara de crescimento tipo BOD, com temperatura e luminosidade controladas. Após 30 dias foram avaliados a porcentagem de explantes sobreviventes e de contaminação. Para o cultivo utilizou-se o meio MT + 1,0 mg L-1 ANA, variando-se as concentrações de BAP em 2,0; 4,0; 6,0 e 12,0 mg L-1. No cultivo avaliou-se o número de calos compactos e friáveis. Para o primeiro e segundo subcultivo o material foi introduzido em meio MT + 1,0 mg L-1 ANA variando-se as mesmas concentrações de BAP, sendo avaliados o número de calos friáveis formados e o tamanho da massa de calos. Foi obtido ainda o número de repetições formadas no decorrer dos subcultivos, peso da matéria fresca (g) e seca (g). Em seguida, foram realizados os testes fitoquímicos para identificação de alguns constituintes. Concluiu-se que o tempo e a concentração de hipoclorito de sódio utilizado, mostraram-se pouco eficientes para a desinfestação. Para a calogênese de Cissus sicyoides L. a partir de segmento foliar faz-se necessário a adição de 6,0 mg L-1 de BAP ao meio de cultivo ...

Secondary metabolites are essentially produced and extracted from plants grown in the field under influence of seasonal variations. The use of biotechnological techniques is an alternative resource for drug production. Among these techniques, tissue culture through callus genesis is highlighted, since callus growth is desirable to induce somaclonal variation and physiological studies, especially when the presence of secondary metabolites can be related to cell growth. The aim of this work was to establish a protocol for Cissus sicyoides L. callus genesis from leaf segments in order to produce metabolites in vitro. Thus, leaf segments removed from adult plants grown in the field were used as explants. After disinfestation, the material was inoculated into MT medium + 1.0 mg L-1 NAA and kept in a BOD chamber, with controlled temperature and luminosity. After 30 days, the percentage of surviving explants and the percentage of contamination were evaluated. For culture, MT medium + 1.0 mg L-1 NAA was used, varying BAP concentrations: 2.0, 4.0, 6.0 and 12.0 mg L-1. In the cultivation, the number of compact and friable calluses was counted. For the first and second subculture, the material was introduced into MT medium + 1.0 mg L-1 NAA, varying the same BAP concentrations; the number of friable calluses formed and the size of callus mass were described. The number of replicates formed during subcultures, and fresh and dry matter (g) were also obtained. Then, phytochemical tests were done in order to identify some compounds. The adopted time and concentration of sodium hypochlorite proved to be inefficient for disinfestation. For Cissus sicyoides L. callus genesis from leaf segments, the addition of 6.0 mg L-1 BAP to the culture medium is needed. Cardiotonic heterosides were detected in Cissus sicyoides L. calluses.

Nitric oxide monocyte production levels in patients with the hepatosplenic form of Scistosoma mansoni infection who underwent splenectomy, ligature of the left gastric vein and auto implantation of spleen tissue in the major omentum / Níveis de óxido nítrico produzidos por monócitos em portadores de esquistossomose hepatoesplênica que se submeteram a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior

PURPOSE: To measure the levels of NO production by monocytes in patients with the hepatosplenic form of schistosomiasis mansoni who underwent splenectomy, ligature of the left gastric vein and auto implantation of spleen tissue in the major omentum. METHODS: Four groups of volunteers were enrolled in the investigation: G1 - 12 patients with S. mansoni infection in its hepatosplenic form without any kind of treatment (SMH); G2 - 13 SMH patients who underwent medical treatment and portal hypertension decompression splenectomy and ligature of the left gastric vein (SMH/SLGV); G3 - 19 patients similar to the later group, but additionally received auto implantation of spleen morsels in the major omentum (SMH/SLGV/AI); and G4 - 15 individuals with no S. mansoni infection coming from the same geographical area and presenting similar socio economical status (CG). Nitrite production by monocytes was determined by a standard Griess reaction adapted to microplates. The results were presented by mean ± SD for each group. Significant differences in NO production by monocytes were determined by Tukey-Kramer multicomparisons test. Probability values of 0.05 were considered significant. RESULTS: Patients from G1 (SMH) showed lower level of NO production by monocytes (5.28 ± 1.28µmol/ml). Patients from G2 (SMH/SLGV) showed similar results (6.67 ± 0.44µmol/ml - q = 2.681 p > 0.05). Individuals of G4 (CG) showed higher level of NO production by monocytes (8.19 ± 2.74µmol/ml). Patients from G3 (SMH/SGLV/AI) showed similar NO production by PBMC as compared to individuals of G4 (CG) - (7.41 ± 1.65µmol/ml - q = 1.615 p > 0.05). The volunteers from G4 (CG) and G3 (SMH/SLGV/AI) showed significantly greater levels of NO production by monocytes as compared to those from G1 (SMH) - (q = 5.837 p < 0.01, and q = 4.285 p < 0.05). CONCLUSION: Collectively, the results point to a restoration of NO normal production by monocytes in SH...

OBJETIVO: Mensurar os níveis de produção de ON por monócitos do sangue periférico (MSP) em portadores de esquistossomose na forma hepatoesplênica que tinham se submetido a esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e auto-implante de tecido esplênico no omento maior. MÉTODOS: Quatro grupos de voluntários foram envolvidos na investigação: G1 - 12 portadores de esquistossomose hepatoesplênica sem nenhuma forma de tratamento (EHE); G2 - 13 portadores de EHE que receberam tratamento clínico e se submeteram cirurgia para descompressão do sistema porta esplenectomia e ligadura da veia gástrica esquerda (EHE/ELGE); G3 - 19 pacientes similares ao do último grupo, mas que receberam também auto-implante de fragmentos de tecido esplênico no omento maior (EHE/ELGE/AI); e G4 - 15 indivíduos sem infecção pelo S. mansoni advindos da mesma área geográfica e apresentando as mesmas condições sócio-econômicas (GC). A produção de ON pelos MSP foi determinada pela reação padrão de Griess, adaptada para poços em microplaca. Os resultados foram expressos por suas médias ± DP para cada grupo. Diferenças significantes nas medias de produção de ON pelos MSP foram determinadas pelo teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer. Foram aceito os limites de significância de p < 0,05. RESULTADOS: Os pacientes portadores de EHE não tratados (G1) evidenciaram os níveis mais baixos de produção de ON pelos MSP (5,28 ± 1,28µmol/ml). Os pacientes do G2 (EHE/ELGE) evidenciaram resultados similares (6,67 ± 0,44µmol/ml - q = 2,681 p > 0.05). Os indivíduos do G4 (GC) evidenciaram os mais altos níveis de produção de ON pelos MSP (8,19 ± 2,74µmol/ml). Os pacientes do G3 (EHE/ELGE/AI) evidenciaram produção de ON produzido pelos MSP similares aos indivíduos do - G4 (GC) (7.41 ± 1.65µmol/ml - q = 1.615 p > 0.05). Os voluntários do G4 (GC) e os do G3 (EHE/ELGE/AI) evidenciaram de forma significante maiores níveis de produção de ON pelos MS...

Proteins in a DNA world: expression systems for their study / Proteínas en el mundo del DNA: Sistemas de expresión para su estudio

Every day, new proteins are discovered and the need to understand its function arises. Human proteins have a special interest, because to know its role in the cell may lead to the design of a cure for a disease. In order to obtain such information, we need enough protein with a high degree of purity, and in the case of the human proteins, it is almost impossible to achieve this by working on human tissues. For that reason, the use of expression systems is needed. Bacteria, yeast, animals and plants have been genetically modified to produce proteins from different species. Even "cell-free" systems have been developed for that purpose. Here, we briefly review the options with their advantages and drawback, and the purification systems and analysis that can be done to gain understanding on the function and structure of the protein of interest.

Cada día, nuevas proteínas son descubiertas y surge la necesidad de caracterizarlas, siendo las de origen humano las que presentan un mayor interés. Conocer su función nos ayudará a entender padecimientos y diseñar una posible cura. Sin embargo, obtener suficiente cantidad de proteínas humanas en cantidad para llevar a cabo los análisis pertinentes, presenta una gran dificultad. Por tal razón, es necesario el uso de sistemas de expresión de proteínas heterólogas. Bacterias, levaduras, animales y plantas han sido modificados genéticamente para expresar proteínas de otras especies, e incluso sistemas in vitro han sido desarrollados para producir proteínas. En este artículo se revisan brevemente las opciones con sus ventajas y desventajas, así como las estrategias de purificación y los análisis que se pueden llevar a cabo para avanzar en el conocimiento de la función y estructura de la proteína de interés.

Preliminary results on embryo rescue for circumventing hybridization barriers in Asparagus

Garden asparagus, Asparagus officinalis, is reproductively isolated from a related ornamental species with potential breeding value, Asparagus densiflorus cv. Sprengeri, by pre- and post-zygotic barriers. The latter barrier operates at the endosperm level five days after pollination in A. officinalis x A. densiflorus crosses. To try to circumvent this barrier, in vitro embryo rescue using ovule and ovary cultures was tested. Controlled interspecific crosses were made and 2,032 ovules and 826 ovaries were cultured three days after pollination under various culture media and incubation conditions. Ovaries cultured for 60 days became red (similar to mature fruits), but seed formation was incomplete. Transfer of ovules to other media was necessary to promote embryo development. The interspecific embryos increased their length from 35 microns at the initiation of culture to 1,900 microns after 120 days of culture, but seedlings were not obtained. Histological studies revealed differentiation of protoderm only. The possible causes of the failure of the embryos to complete differentiation and morphogenesis are discussed.

Morphogenesis in short-term and long-term anther derived calli of Oenothera hookeri de vries

Anther culture of O. hookeri on Murashige and Skoog (1962) medium supplemented with 2 mg l-1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2 mg-1 1-naphthaleneacetic acid produced callus formation. When subcultured onto medium lacking auxin, the callus regenerated through the organogenic pathway. Non-organogenic and organogenic callus was observed using histological methods after 2, 3 and 24 weeks in culture. Three types of calli were recognized: non-organogenic friable calli, organogenic friable calli with roots and organogenic hard calli with shoots. The microscopical sections showed striking differences in tissue organization among friable and compact calli. Vascular bundles were prominent in compact calli, but were not found in friable calli. Calli sections showed at light microscopy cells at two developmental stages; differentiated highly vacuolated cells and meristematic small isodiametric cells with densely stained cytoplasm. At electron microscopy level abnormal chloroplasts were present in non-organogenic calli, while chloroplasts were well developed in organogenic hard calli. Peroxisomes with paracrystalline protein bodies were abundant in both types of calli.

K+ balance in rainbow trout gill and liver tissue, cell suspensions and cultured cells

Both intact gill and liver tissue from rainbow trout accumulated K+, as determined by 86Rb+ uptake, a process largely inhibited by ouabain, indicating the presence of functional NaKATPase. Cell suspensions, produced by disaggregation of gill or liver tissues, accumulated very little K+ compared to tissues (Less than 10 percent). Disaggregation resulted in depolarisation of cells with loss of intracellular K+ and although NaKATPase, as measured by 86Rb+ uptake rate, remained functional and inhabitable by ouabain, the activity was insufficient to replace the rapid K+ loss. While attached, cultured gill and liver cells showed normal K+/Na+ ratios and NaKATPase activity, but release from the substratum resulted in depolarisation and rapid K+ loss as seen in cell suspensions. These results suggest that care is required in interpreting ionic regulatory and other results from cell suspensions and that further research should be directed towards systems where cells can maintain normal ionic balance.

Influencia de las condiciones de cultivo de placenta humana sobre la producción de medios condicionados placentarios / Influence of culture conditions on the production of human placent conditioned medium

En este trabajo se propone una técnica alternativa para la obtención de medios condicionados derivados de placenta humana. Se cultivaron homogenatos placentarios en Mc Coy's 5A suplementado con suero fetla bovino al 5 por ciento y 25mM de HEPES a 37oC. Luego de seis días, los cultivos fueron sacrificados, verificándose la esterilidad y la viabilidad celular. El sobrenadante fue centrifugado a 22.000 g 30 min a 4oC y esterilizado por filtración (0,22 um), denominándolo Medio Condicionado de Placenta Humana (MCPH). Se probó la actividad de los extractos, así obtenidos, en cultivos de linfocitos periféricos de mujeres con tres hijos, con la adición de MCPH al 5 por ciento ,10 por ciento y 20 por ciento y se determinó el índice de Transformación Blástica Linfocitaria (ITBL). La máxima estimulación se observó en los cultivos linfocitarios que contenían MCPH al 10 por ciento , siendo estos valores más uniformes que losa producidos con MCPH al 10 por ciento obtenidos por otra técnica. en conclusión, con esta metodología es posible obtener medios condicionados placentarios con una actividad estimulante más uniforme, independientemente de la placenta de la cual provengan

Prolactin effects on testicular interstitial cells in primary cultures

En el presente trabajo se determinaron los efectos de la prolactina (PRL) "in vitro" sobre la esteroidogénesis testicular, utilizando un cultivo primario de células intersticiales de rata inmadura. Las células fueron cultivadas en un medio químicamente definido, con el agregado de insulina y transferrina durante 2 días a 34§C. La producción de andrógenos durante el segundo día de cultivo resultó ser significativamente mayor que en el primer día (3 alfa-Androstandiol (3 alfa-Diol) 5.14 ñ 0.46 vs. 3.74 ñ 0.10 ng/microng ADN, p < 0.001); Testosterona (T) + Dihidrotestosterona (DHT) 0.40 ñ 0.04 vs. 0.34 ñ 0.03 ng/microng ADN, p < 0.001). La curva dosis respuesta para distintas dosis de hCG mostró un ED50= 2.5 mUI/ml. El efecto agudo de la PRL (10, 100 y 1000 ng/ml) sobre la producción basal de 3 alfa/Diol se evaluó luego de 45 h de cultivo. Sólo la dosis de PRL de 1000 ng/ml reveló diferencias significativas con respcto al control y dicho efecto pordría ser debido a su contaminación con LH. En otra serie de experimentos se evaluaron los efectos de menores dosis de la hormona a tiempos prolongados. La PRL (10 ng/ml), agregada durante todo el tiempo de cultivo, causó una inhibición significativa en la producción basal de 3 alfa-Diol, mientras que la respuesta a un estímulo máximo con hCG no varió. Cuando se determinó la producción de T+DHT se observó un cambio notorio en la relación T+DHT/Diol, tanto en condiciones basales (Control: 0.09 vs. PRL: 0.38) como ante el estímulo con hCG...