Expression of TIM-3, Human beta-defensin-2, and FOXP3 and Correlation with Disease Activity in Pediatric Crohn's Disease with Infliximab Therapy

BACKGROUND/AIMS: This study investigated the expression of T cell immunoglobulin- and mucin-domain-containing molecule 3 (TIM-3), human beta-defensin (HBD)-2, forkhead box protein 3 (FOXP3), and the frequency of CD4+ CD25+ FOXP3+ regulatory T cells (Tregs) in children with Crohn's disease (CD) during infliximab therapy. METHODS: We enrolled 20 CD patients who received infliximab treatment for 1 year. Peripheral blood and colonic mucosal specimens were collected from all CD patients and from healthy control individuals. RESULTS: A significant difference in TIM-3 mRNA expression was evident in peripheral blood mononuclear cells and colonic mucosa between CD patients before infliximab therapy and the healthy controls (p<0.001 and p=0.005, respectively). A significant difference in HBD-2 mRNA expression was found in colonic mucosa between CD patients before infliximab therapy and the healthy controls (p=0.013). In the active phase of CD, at baseline, the median percentage of T cells that were CD25+ FOXP3+ was 1.5% (range, 0.32% to 3.49%), which increased after inflixmab treatment for 1 year to 2.2% (range, 0.54% to 5.02%) (p=0.008). CONCLUSIONS: Our study suggests that both the adaptive and innate immune systems are closely linked to each other in CD pathogenesis. And the results of our study indicate that it could be a useful therapeutic tool, where restoration of TIM-3, HBD-2 and the function of Tregs may repair the dysfunctional immunoregulation in CD.

Changes in the Expression and Distribution of Claudins, Increased Epithelial Apoptosis, and a Mannan-Binding Lectin-Associated Immune Response Lead to Barrier Dysfunction in Dextran Sodium Sulfate-Induced Rat Colitis

BACKGROUND/AIMS: This animal study aimed to define the underlying cellular mechanisms of intestinal barrier dysfunction. METHODS: Rats were fed 4% with dextran sodium sulfate (DSS) to induce experimental colitis. We analyzed the sugars in 24-hour urine output by high pressure liquid chromatography. The expression of claudins, mannan-binding lectin (MBL), and MBL-associated serine proteases 2 (MASP-2) were detected in the colonic mucosa by immunohistochemistry; and apoptotic cells in the colonic epithelium were detected by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling method assay. RESULTS: The lactulose and sucralose excretion levels in the urine of rats with DSS-induced colitis were significantly higher than those in the control rats. Mannitol excretion was lower and lactulose/mannitol ratios and sucralose/mannitol ratios were significantly increased compared with those in the control group (p<0.05). Compared with the controls, the expression of sealing claudins (claudin 3, claudin 5, and claudin 8) was significantly decreased, but that of claudin 1 was increased. The expression of pore-forming claudin 2 was upregulated and claudin 7 was downregulated in DSS-induced colitis. The epithelial apoptotic ratio was 2.8%+/-1.2% in controls and was significantly increased to 7.2%+/-1.2% in DSS-induced colitis. The expression of MBL and MASP-2 in the intestinal mucosa showed intense staining in controls, whereas there was weak staining in the rats with colitis. CONCLUSIONS: There was increased intestinal permeability in DSS-induced colitis. Changes in the expression and distribution of claudins, increased epithelial apoptosis, and the MASP-2-induced immune response impaired the intestinal epithelium and contributed to high intestinal permeability.

Effect of Bacillus subtilis PB6, a natural probiotic on colon mucosal inflammation and plasma cytokines levels in inflammatory bowel disease.

The pathophysiology of inflammatory bowel disease (IBD) involves the production of diverse lipid mediators, namely eicosanoid, lysophospholipids, and platelet-activating factor, in which phospholipase A2 (PLA2) is the key enzyme. Thus, it has been postulated that control of lipid mediators production by inhibition of PLA2 would be useful for the treatment of IBD. This hypothesis has been tested in the present study by examining the therapeutic effect of a novel natural probitic Bacillus subtilis PB6 (ATCC- PTA 6737). B. subtilis PB6 is found to secrete surfactins (cyclic lipopeptides) which have anti-bacterial potential. These surfactins inhibit PLA2, a rate-limiting enzyme involved in the arachidonic acid associated inflammatory pathway and could downregulate the inflammatory response by regulating the eicosanoid and cytokine pathways. With this concept, an experimental animal trial has been conducted in a rat model of 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis. The oral administration of PB6 suppresses the colitis as measured by mortality rate, changes in the weight gain, colon morphology and the levels of plasma cytokines. The animals treated orally with PB6 at 1.5 x 10(8) CFU/kg thrice daily from day 4 to 10 significantly improve gross pathology of the colon and regain the colon weight to normal (p < 0.05), compared to TNBS-induced positive control. The plasma levels of pro-inflammatory cytokines (TNF-alpha, 1L-1beta, IL-6 and IFN-gamma) are also significantly lowered (p < 0.05) and anti-inflammatory cytokine (IL-I0 and TGF-beta) significantly (p < 0.05) increased after the oral administration of PB6 on day 11. The present study supports the concept that PB6 inhibits PLA2 by the secreting surfactins. In a clinical investigation, it is found to be well tolerated by all the healthy volunteers.

Estudo imunohistológico do linfócito T (total e auxiliador) e do linfócito B da mucosa colónica de crianças portadoras de doença de Crohn e retocolite ulcerativa inespecífica / Immunohistological study of the T-lymphocyte (total and helper) and the B-lymphocyte of the colonic mucous in children with Crohn's disease and unspecific ulcerative colitis

Para melhor compreensao dos mecanismos imunológicos envolvidos na mucosa colônica da retocolite ulcerativa inespecífica e da doença de Crohn, foram estudadas as mucosas colônicas de 19 crianças com retocolite ulcerativa inespecífica, 12 crianças com doença de Crohn e um grupo controle representado por 10 espécimes de mucosa retal de pacientes com obstipaçao intestinal crônica inespecífica. As mucosas foram coradas com a técnica de imunoperoxidase, e os linfócitos T (total e auxiliador) e B foram identificados com marcadores específicos - para os linfócitos T total, CD3, linfócitos T auxiliador, CD4 e para o B, CD20 - e quantificadas na lâmina própria através de análise de imagem computadorizada cromática em diferentes períodos evolutivos da doença: PI (antes do tratamento), PH (até dois anos de evoluçao) e PIII (com mais de dois anos de evoluçao). No epitélio superficial foi quantificado apenas o linfócito T total, através de contagem linear. O marcador CD3, do linfócito T total, esteve aumentado no epitélio (superficial e glandular) e na lâmina própria das mucosas doentes em relaçao às do controle. Na mucosa dos pacientes, esteve distribuído difusamente, concentrando-se ao redor dos microgranulomas, no interior dos nódulos linfóides e nas áreas lesadas em proximidade aos macrófagos. Na doença de Crohn, PI, sua média na lâmina própria diferiu significantememte em relaçao ao controle. Comportamento semelhante ocorreu com o marcador CD20 do linfócito B nas mucosas doentes, cujas médias foram superiores aos do controle, embora apenas no PI da doença de Crohn essa diferença tenha sido significativa. O marcador CD4 do linfócito T auxiliador também apresentou nas mucosas doentes médias elevadas em relaçao à mucosa controle, mas sem significaçao estatística. As células CD4+ distribuíram-se difusamente por toda altura da mucosa doente, concentrando-se ao redor dos nódulos linfóides e dos microgranulomas. De modo geral, todos os marcadores estudados neste trabalho apresentaram médias superiores aos do grupo controle com diferentes graus de significância nos diferentes períodos estudados. Esses resultados confirmam a participaçao desses elementos na patogênese da retocolite ulcerativa inespecífica e da doença de Crohn. Os achados de correlaçao positiva entre os marcadores CD4 e CD20 na retocolite ulcerativa inespecífica e CD3 e CD20...

Estudo imunohistoquímico da expressäo HLA-DR no epitélio superficial e na lâmina própria da mucosa colônica de crianças portadoras de doença de Crohn e retocolite ulcerativa inespecífica / Immunohistochemical study of the HLA-DR expression in the superficial epithelium and in the lamina propria of the colonic mucosa in children with Crohn's disease and nonspecific ulcerative colitis

Alguns estudos têm realçado a importância da expressao HLA-DR no epitélio superficial e na lâmina própria da mucosa dos pacientes portadores de retocolite ulcerativa inespecífica e doença de Crohn. Neste estudo foram quantificadas e analisadas as características histológicas da expressao HLA-DR na mucosa colônica nestas duas doenças. Foram estudados 12 pacientes em doença de Crohn, 19 com retocolite ulcerativa inespecífica e 10 espécimes de mucosa retal representando o grupo controle, de acordo com o seguinte modelo: período I = pé-tratamento; período II = até dois anos de evoluçao e período III = mais de dois anos de evoluçao. A expressao HLA-DR foi identificada pelo monoclonal HLA-DR (DAKO) em espécimes de mucosa colônica pelo método de imunoperoxidase. A quantificaçao da expressao HLA-DR na lâmina própria foi feita através de análise de imagem computadorizada cromática, que expressa em porcentagem a área (mum2) ocupada pelas células HLA-DR positivas e no epitélio superficial quantificada por uma avaliaçao semi-quantitativa. Na lâmina própria da mucosa dos doentes a expressao HLA-DR esteve aumentada em todos osperíodos estudados, quando comparada com o grupo controle, porém sem diferença estatística. A distribuiçao da expressao HLA-DR na lâmina própria foi em localizaçoes correspondentes aos macrófagos e aos linfócitos B. O epitélio colônico superficial dos pacientes com retocolite ulcerativa inespecífica e com retocolite ulcerativa inespecífica e com doença de Crohn foi HLA-DR positivo em 86,95 por cento e 80,96 por cento, respectivamente, nos três períodos estudados. O epitélio superficial de todas as mucosas retais do grupo controle nao mostraram a expressao HLA-DR. A presença da expressao HLA-DR no epitélio colônico superficial dos pacientes com retocolite ulcerativa inespecífica e doença de Crohn e sua ausência no epitélio do grupo controle foi um achado de grande importância neste estudo. É consenso entre os diversos autores que a expressao HLA-DR representa uma intensa açao local das citocinas indutoras desta expressao na mucosa colônica dos pacientes com retocolite ulcerativa inespecífica e donça de Crohn, representando a sua ativaçao em resposta ao antígeno invasor da mucosa intestinal. O estudo da expressao HLA-DR na lâmina própria nao foi conclusivo, pois o resultado nao representou diferença significativa em relaçao ao controle.

Respuesta inmune en conejos a extractos de tejidos tumoral de colón humano / Immune response in rabbits to tumoral tissue extracts of human colon

Se aisló y purificó antígeno carcinoembriónico (CEA) a partir de tumores de colon humano; se obtuvieron antisueros al extracto perclórico de glicoproteínas de colon normal y de colon tumoral, y al CEA puro en conejos. Se comprobó por electroforesis en gel de poliacrilamida que, al inmunizar en forma prolongada con el extracto tumoral, hubo aumento de proteínas de movilidad alfa2. Los antisueros obtenidos rinden por imnunodifusión bajos títulos al enfrentarlos a los distintos antígenos examinados. En general se obtienen los mayores títulos con la fracción obtenida por focalización isoeléctrica del extracto perclórico de glico proteínas de colon tumoral, y este fenómeno se repite al titular los antisueros por radioinmunoensayo (RIE). Al efectuar el análisis estadístico de los resultados obtenidos al medir la concentración de CEA en muestras de sueros de pacientes, no se obtuvieron diferencias significativas al usar sueros provenientes de distintas sangrías. Se concluye que para cubrir un amplio rango de concentraciones en la medición de CEA por RIE es suficiente purificar al antígeno que se usará, como "standard" y trazador hasta la etapa de focalización, y utilizar de anti-sueros obtenidos de animales inyectados con extracto perclórico de glicoproteínas de colon tumoral con esquemas de inmunización largos o con CEA puro con un esquema corto