Diagnóstico da infecção por trematódeos em moluscos através de Multiplex-PCR

A Fasciola hepatica têm despertado interesse médico e veterinário nos últimos anos, uma vez que, os casos de fasciolose humana e animal se tornam cada vez mais freqüentes em todo o mundo. Da mesma forma, o S. mansoni continua sendo estudado em decorrência de seu grande impacto sócio-econômico e na saúde pública. O diagnóstico clássico da infecção de S. mansoni em Biomphalaria bem como de F. hepatica em limneídeos é feito rotineiramente em laboratório através de exames dos moluscos após estímulo luminoso (exposição à luz artificial) para observação de cercárias, e/ou dissecando ou esmagando os moluscos, onde além de se observar cercárias também observa-se a presença de rédias (no caso de F. hepatica) e esporocistos, principalmente se estes estiverem localizados na glândula digestiva. Entretanto o encontro de larvas de helmintos em moluscos quase sempre traz resultados inconclusivos, uma vez que existe uma grande semelhança morfológica entre formas intramolusco de trematódeos. No presente trabalho, foi desenvolvido um diagnóstico molecular rápido e eficaz capaz de detectar F. hepatica e S. mansoni em seus hospedeiros intermediários

Com o intuito de detectar a infecção de S. mansoni e, simultaneamente identificar a espécie de Biomphalaria, utilizamos a Multiplex-PCR para amplificar a região ITS2 dos caramujos e a região do DNAmt desse trematódeo, utilizando simultanemente 6 iniciadores. Esse procedimento permitiu diagnosticar a infecção pelo S. mansoni e realizar a identificação espécie-específica do molusco parasitado, em uma única reação (artigo 1). Para a detectar a infecção de limneídeos por F. hepatica realizamos a Multiplex-PCR, utilizando 4 iniciadores em uma única reação, sob condições de alta estringência, permitindo a amplificação específica do DNA do trematódeo e do molusco (artigo 2). Este método foi altamente sensível, detectando a infecção por até um miracídio de F. hepatica no período pré-patente da infecção, não amplificando DNA de outros trematódeos. Além da especificidade, a Multiplex-PCR também permite o uso de um eficiente controle interno da reação pela amplificação do DNA do molusco. A via migratória e as alterações histopatológicas causadas por helmintos em moluscos têm sido estudadas através de técnicas histológicas

Diante das dificuldades encontradas em se identificar especificamente a presença de trematódeos em limneídeos através apenas da análise de cortes histológicos sob microscópio de campo claro, padronizamos um método sensível capaz de extrair DNA de cortes histológicos em lâminas que foram previamente fixados em formalina, embebidos em parafina e corados com HE (artigo 3). Essa metodologia permitiu detectar a presença de F. hepatica em L. viatrix através da Multiplex-PCR, que mostrou ser um método rápido, seguro e específico, altamente sensível capaz de amplificar DNA de tecidos fixados, a despeito da baixa quantidade de DNA e da degradação causada pelo processo de fixação, possibilitando detecção da presença da F. hepatica mesmo em lâminas onde não era possível observar estágios larvais desse trematódeo através da análise sob microscópio óptico. Dessa forma, as metodologias moleculares, propostas no presente trabalho, para identificação de trematódeos em seus hospedeiros intermediários contribuirão para um avanço em estudos epidemiológicos e de controle da fasciolose e da esquistossomose

Diagnóstico da infecção por trematódeos em moluscos através de Multiplex-PCR / Diagnosis of infection by trematodes in snails by Multiplex-PCR

A Fasciola hepatica têm despertado interesse médico e veterinário nos últimos anos, uma vez que, os casos de fasciolose humana e animal se tornam cada vez mais freqüentes em todo o mundo. Da mesma forma, o S. mansoni continua sendo estudado em decorrência de seu grande impacto sócio-econômico e na saúde pública. O diagnóstico clássico da infecção de S. mansoni em Biomphalaria bem como de F. hepatica em limneídeos é feito rotineiramente em laboratório através de exames dos moluscos após estímulo luminoso (exposição à luz artificial) para observação de cercárias, e/ou dissecando ou esmagando os moluscos, onde além de se observar cercárias também observa-se a presença de rédias (no caso de F. hepatica) e esporocistos, principalmente se estes estiverem localizados na glândula digestiva. Entretanto o encontro de larvas de helmintos em moluscos quase sempre traz resultados inconclusivos, uma vez que existe uma grande semelhança morfológica entre formas intramolusco de trematódeos. No presente trabalho, foi desenvolvido um diagnóstico molecular rápido e eficaz capaz de detectar F. hepatica e S. mansoni em seus hospedeiros intermediários.

Com o intuito de detectar a infecção de S. mansoni e, simultaneamente identificar a espécie de Biomphalaria, utilizamos a Multiplex-PCR para amplificar a região ITS2 dos caramujos e a região do DNAmt desse trematódeo, utilizando simultanemente 6 iniciadores. Esse procedimento permitiu diagnosticar a infecção pelo S. mansoni e realizar a identificação espécie-específica do molusco parasitado, em uma única reação (artigo 1). Para a detectar a infecção de limneídeos por F. hepatica realizamos a Multiplex-PCR, utilizando 4 iniciadores em uma única reação, sob condições de alta estringência, permitindo a amplificação específica do DNA do trematódeo e do molusco (artigo 2). Este método foi altamente sensível, detectando a infecção por até um miracídio de F. hepatica no período pré-patente da infecção, não amplificando DNA de outros trematódeos. Além da especificidade, a Multiplex-PCR também permite o uso de um eficiente controle interno da reação pela amplificação do DNA do molusco. A via migratória e as alterações histopatológicas causadas por helmintos em moluscos têm sido estudadas através de técnicas histológicas.

Diante das dificuldades encontradas em se identificar especificamente a presença de trematódeos em limneídeos através apenas da análise de cortes histológicos sob microscópio de campo claro, padronizamos um método sensível capaz de extrair DNA de cortes histológicos em lâminas que foram previamente fixados em formalina, embebidos em parafina e corados com HE (artigo 3). Essa metodologia permitiu detectar a presença de F. hepatica em L. viatrix através da Multiplex-PCR, que mostrou ser um método rápido, seguro e específico, altamente sensível capaz de amplificar DNA de tecidos fixados, a despeito da baixa quantidade de DNA e da degradação causada pelo processo de fixação, possibilitando detecção da presença da F. hepatica mesmo em lâminas onde não era possível observar estágios larvais desse trematódeo através da análise sob microscópio óptico. Dessa forma, as metodologias moleculares, propostas no presente trabalho, para identificação de trematódeos em seus hospedeiros intermediários contribuirão para um avanço em estudos epidemiológicos e de controle da fasciolose e da esquistossomose.