Rabbit IgG antibodies against Phospholipase A2 from Crotalus durissus terrificus neutralize the lethal activity of the venom

Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) (South American rattlesnake) venom possesses myotoxic and neurotoxic activities, both of which are also expressed by crotoxin, the principal toxin of this venom. Crotoxin contains a basic phospholipase A2 (PLA2) and a non toxic acidic protein, crotapotin. We have produced and investigated the ability of IgG antibodies raised in rabbits against PLA2 to neutralize the lethality of the whole venom. PLA2 was isolated by gel filtration chromatography (Sephadex G-75). Specific antibodies were obtained by subcutaneous and intramuscular inoculation of PLA2 (700 µg) with Freund adjuvant. Groups of six mice (20 + 2 g) were inoculated with 0.5 ml i.p. of C. d. t. venom (4 µg) or a mixture of venom that had been preincubated with the desired volume of IgG antibodies. Mortality, recorded 24 and 48 h after inoculation, showed that IgG anti-PLA2 were more effective than anticrotalic serum in neutralizing the lethal activity. These results demonstrate that it could be possible to obtain an anti-venom made by specific antibodies with a high level of protection against the lethal component of C.d.t. venom, and/or the inclusion of these antibodies as a supplement in heterologous anti-venoms

El veneno de Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) (Cascabel de Sud América) posee actividad miotóxica y neurotóxica, actividades que también exhibe el complejo crotoxina, principal componente tóxico de este veneno. El complejo crotoxina está constituido por una fosfolipasa A2 básica (PLA2) y una proteína acídica no tóxica, el crotapotín. En este trabajo se estudió la capacidad neutralizante de anticuerpos IgG anti-PLA2 sobre la letalidad inducida por el veneno entero. El antígeno PLA2, fue aislado por cromatografía de filtración en gel (Sephadex G-75). Se inocularon conejos machos por vía subcutánea e intramuscular, con 700 µg de PLA2 y adyuvante para la obtención de anticuerpos específicos. La capacidad neutralizante del antisuero se analizó en ratones por inoculación con diluciones de veneno entero preincubado con un volumen adecuado de anticuerpos IgG anti-PLA2. Se inocularon ratones controles con 0.5 ml i.p. de veneno (4 µg.ml-1). El número de muertes fue contabilizado a las 24 y 48 h posteriores a la inoculación, demostrándose que la capacidad neutralizante de los anticuerpos IgG anti-PLA2 fue superior a la obtenida con el antiveneno crotálico. Los resultados obtenidos demuestran la potencial aplicación de antivenenos constituidos por anticuerpos específicos contra PLA2, y/o la inclusión de estos anticuerpos como suplementos en antivenenos polivalentes

A sensitive and specific immunoassay for the measurement of the antibodies present in horse antivenoms endowed with the capacity to block the phospholipase A2-dependent hemolysis induced by snake venoms

Phospholipase A2(PLA2), a component of most snake venom toxins, cleaves 3-sn-phosphoglycerides releasing lysophosphatidyl-choline. The indirect quantitative assay method for PLA2 was standardized for specific antivenom titration in a fast and sensitive assay by the similarity with the hemolysis induced by PLA2 and by complement system in sheep erythrocytes. The curves obtained by plotting the degree of hemolysis against the doses of snake venom are concave to the abscissa to the abscissa axis following an equation similar to that previously described for the hemolysis induced by the C system. We observed that venoms of some Bothrops, Crotalus and Micrurus species contained around 1 X 10(3) to 10(4) Z/mg of venom, while the venom of Naja contained over one million Z/mg. Antibodies against PLA2 were titrated by incubating amounts of venom predetermined to give 1 to 5 Z with various dilutions of the antivenoms, and the remaining active PLA2 was determined in the hemolytic assay. We observed the following: a) the antivenoms contained specific antibodies against the PLA2 present in the corresponding venoms; b) cross-reactivity was not detected among PLA2 epitopes from venoms and nonspecific antivenoms: and c) the assay quantitatively performed determined the specific antibodies directed to epitopes on the molecule of PLA2. The method described in this highly specific, sensitive and reproducible, besides being fast and inexpensive.

Desarrollo de la respuesta de anticuerpos anti-fosfolipasa A2 en caballos inoculados con veneno para la producción de suero antiofídico polivalente en Costa Rica / Development of antibody anti-phospholipase A2 response in inoculated horses with venom for the productions of polivalent antiofidico serum in Costa Rica

Se estudió el desarrollo de la respuesta inmune y las alteraciones en el estado general en un grupo de ocho caballos adultos sanos utilizados en la producción del suero antiofídico polivalente en el Instituto Clodomiro Picado. Se observó una gran variación individual en la elevación del título de anticuerpos aunque, en términos generales, los máximos títulos se alcanzaron luego de que se inocularon las dosis de 30 mg y 50 mg de la mezcla de venenos. Con respecto a caballos que habían sido previamente utilizados en la producción de suero y que recibieron una dosis de refuerzo, el máximo título se obtuvo entre los 16 y 22 días. Las inoculaciones de la mezcla de venenos indujeron alteraciones leves en el estado general de los cabllos. Sin embargo, la mayoría de ellos desarrollaron abscesos, fístulas y fibrosis en el sitio de inoculación del veneno. Se concluye que, dada la gran variabilidad individual de los caballos en lo que respecta a la respuesta inmune, se hace necesaria su evaluación individual, con el fin de seleccionar los animales que produzcan una respuesta satisfactoria