Efeito da ciclohexilamina sobre trofozoitos de Giardia Lamblia / Cyclohexylamine effect on Giardia lamblia trophozoites

A giardíase é uma doença causada pelo protozoário flagelado Giardia lamblia, e sua sintomatologia é caracterizada pela eliminação de fezes esteatorréicas, dores abdominais e náuseas. Segundo o CDC estima-se que há cerca 1,2 milhões de casos por ano de giardíase, acometendo principalmente crianças em idade escolar. Atualmente, o tratamento da giardíase é realizado principalmente pelo uso do fármaco da família dos 5-nitromidazóis, metronidazol (Flagyl®), secnidazol e tinidazol em particular. Estes são confrontados em casos de resistência clínica causada pelo frequente uso inadequado do medicamento e/ou abandono do tratamento. Além disso, o metronidazol pode apresentar efeito carcinogênico em longo prazo em humanos. Desta forma, novos estudos com análogos e/ou inibidores de poliaminas podem levar à elucidação dos mecanismos de ação envolvidos, favorecendo o estabelecimento de novos regimes terapêuticos mais seguros e eficazes. Em nosso trabalho, foram testadas as substâncias ciclohexilamina (CHA) e o metronidazol que são produtos sintéticos, com o objetivo de avaliar os seus efeitos na proliferação celular, caracterização dos moduladores do metabolismo de poliaminas, avaliação nas mudanças no potencial redox e elucidação de seus possíveis mecanismos de ação nos trofozoítos de Giardia lamblia. Foi realizada uma avaliação da proliferação celular na presença de CHA para trofozoítos de Giardia lamblia, onde observamos que a substância demonstrou ter ação siginficativa apresentando um efeito dosedependente. Observamos que os trofozoítos de G. lamblia apresentam uma inibição significativa do crescimento em presença de concentrações milimolares do CHA, cujo IC50 em 72 horas foi de 1,646 mM...

Giardiasis is a disease caused by the flagellate protozoan Giardia lamblia, and its symptomatology is characterized by steatorrhea, abdominal pain and nausea. According to the CDC, an estimate number of 1.2 million cases of giardiasis happen every year, affecting especially schoolchildren.Nowadays, giardiasis treatment is based on drugs from the 5-nitroimidazole family, particularly metronidazole (Flagyl), secnidazole and tinidazole. Those drugs are indiscriminately used by the population, and it's not uncommon to find them causing clinical resistance due to inappropriate utilization and/or tratment abandon. Besides that, metronidazole can present longterm carcinogenic effect in humans. Thus, new studies with analogs and/or polyamines inhibitors can lead to the clarification of the drugs action mechanis, favouring the establishment of new, safer and more efficient therapeutic regimens.Our work tested cyclohexylamine (CHA) and metronidazole, wich are synthetic products, in order to evaluate their effects on cell proliferation and on changes in redox potential, characterize polyamines metabolism modulator and describe their possible action mechanisms on Giardia lamblia trophozoites. We evaluated Giardia lamblia trophozoites cell proliferation in the presence of CHA; it was observe that the substance shows significant action, presenting dose-dependent effect. We also observed that G. lamblia trophozoites presented significant growth inhibition when exposed to millimolar concentrations of CHA - its IC50 in 72 hours was 1,646mM...

Obtención, purificación y caracterización de anticuerpos policlonales IgY desarrollados en gallina, dirigidos contra aislamientos colombianos de Giardia duodenalis / Obtention, purification and characterization of IgY polyclonal antibodies, developed in hens,

Introducción. El desarrollo de anticuerpos policlonales requiere de animales de laboratorio, generalmente, el conejo, que deben sangrarse para su obtención. Como alternativa, se han utilizado las gallinas. Objetivo. Desarrollar anticuerpos policlonales IgY anti- Giardia duodenalis y evaluar diferentes métodos para su purificación a partir de yema de huevo. Materiales y métodos. Se inmunizaron tres gallinas intramuscularmente con trofozoítos del parásito: las inmunizaciones se realizaron a los 0, 15, 30, 45, 60, 90 y 120 días. Se recolectaron huevos en cada etapa de la inmunización y se purificó la IgY por deslipidación (D) y precipitación(P) mediante cinco protocolos diferentes: M1: (P: sulfato de amonio/D: dextrán sulfato-cloruro de calcio), M2: (D: dextrán sulfato-cloruro de calcio/P: sulfato de amonio), M3: (D: cloroformo/ P: sulfato de amonio 50 por ciento), M4: (D: solución A/P:solución B) y M5: (D: cloroformo/P: sulfato de amonio 30 por ciento). Se realizó evaluación inmunoquímica de la IgY anti- Giardia duodenalis mediante inmunodifusión, contrainmunoelectroforesis e inmunoelectrotransferencia ( Western blot); la pureza de IgY por SDS-PAGE en presencia y ausencia de reductor y la concentración de la inmunoglobulina (mg/mL) por espectrofotometría y densitometría. Resultados. La IgY anti- G. duodenalis mediante evaluación inmunoquímica presentó títulos hasta de 1:32. La inmunoglobulina en ausencia de reductor mostró una banda de 180 kd y en su presencia bandas de 30 y 68 kd, características de sus cadenas liviana y pesada, respectivamente. Las mayores concentraciones de inmunoglobulina se recuperaron con el método dos (M2), 4,6 mg de IgY por mL de yema de partida. Conclusiones. Por su facilidad y economía de producción en gallinas, los anticuerpos policlonales IgY anti- Giardia así obtenidos podrán utilizarse para desarrollar inmunoensayos que detecten el parásito en eluídos de heces

Análise bioquímica e antigênica de trofozoítos de cepas de origem humana de Giardia duodenalis, Lambl (1859), isoladas e axenizadas em Botucatu, SP / Analysis biochemistry and antigenic trophozoites strains of human origin of Giardia duodebalis, Lambi (1859), isolated and axenic in Botucatu, SP

Foi realizada a análise de algumas características bioquímicas e antigênicas de duas cepas axênicas de Giardia duodenalis, isoladas em Botucatu, a partir de cistos obtidos de pacientes sintomático (BTU-11) e assintomático (BTU-10), tendo por referência a cepa padrão Portland 1 (P-1), isolada e axenizada nos Estados Unidos. O objetivo desta análise foi o de se investigar diferenças entre as cepas correlacionando-as à forma clínica. Preparações contendo proteínas de membranas, proteínas solúveis (citosol) e lisados de cada cepa foram empregados na eletroforese das proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), na análise de glicoproteínas pela técnica de Con A blot, na análise antigênica pela técnica de "lmmunoblottinç" e na análise da atividade proteolítica em gel de poliacrilamida copolimerizado com.gelatina. Na análise do perfil eletroforético os padrões de bandas de proteínas das cepas BTU-10 e BTU-11 foram complexos e na maior parte homogêneos; algumas diferenças foram detectadas entre as proteínas de membranas. Várias glicoproteínas foram demonstradas, destacando-se as de 81,72, 59 kDa e a glicoproteína de 62 kDa, detectadas nas preparações de proteínas de membranas e proteínas solúveis, respectivamente. Entre estas glicoproteínas, a de 81 kDa foi detectada apenas entre as proteínas de membranas das cepas BTU-11 e P-1, isoladas de casos sintomáticos. Vários componentes antigênicos foram reconhecidos por anticorpos IgG de coelho pela técnica de "Immunoblotting". Entre estes componentes, as proteínas de 32 kDa, entre as proteínas de membranas e a de 30 kDa, entre as proteínas solúveis, parecem tratar-se de proteínas já caracterizadas como "Giardinas". Antígenos reconhecidos por IgG humana foram identificados apenas entre as proteínas de membranas, destacando-se as bandas de 64,62, 58, 52 e 47 kDa...

In the present investigation, we analysed the biochemical and antigenic characteristics of two axenic strains of Giardia duodenalis, isolated from a symptomatic (BTU-11) and an asymptomatic patient (BTU-10), in the Campus of Botucatu, UNESP. The axenic strain Portland 1 (P-1), isolated in the United States, was used as a reference strain. We aimed at detecting differences between the strains and to correlate them with the clinical presentation. Fractions containing membrane proteins or soluble proteins (cytosol proteins), and Iysates from each strain were tested in sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for the pattern of proteins, in concanavalin-A blotting for the profile of glycoproteins and in pólyacrylamide gel co-polymerized with gelatin for evaluation of the proteolytic activity. Both Botucatu strains showed a complex and homogeneous electrophoretic pattern of proteins with some differences among membrane proteins. Several glycoproteins (gp) were detected, particularly gp81, 72, 59 kDa and gp62 in the membrane proteins and cytosol proteins, respectively. Gp 81 was demonstrated only in the membrane proteins of the BTU-11 and P-1 strains from symptomatic patients. Many antigenic components were reavealed by anti-Giardia rabbit IgG antibodies in the immunoblotting analysis. Among these components, the membrane protein p32 and cytosol protein p30 corresponded to giardin, as previously demonstrated...

Análise bioquímica e antigênica de trofozoítos de cepas de origem humana de Giardia duodenalis, Lambl (1859), isoladas e axenizadas em Botucatu, SP / Analysis biochemistry and antigenic trophozoites strains of human origin of Giardia duodebalis, Lambi (1859), isolated and axenic in Botucatu, SP

Foi realizada a análise de algumas características bioquímicas e antigênicas de duas cepas axênicas de Giardia duodenalis, isoladas em Botucatu, a partir de cistos obtidos de pacientes sintomático (BTU-11) e assintomático (BTU-10), tendo por referência a cepa padrão Portland 1 (P-1), isolada e axenizada nos Estados Unidos. O objetivo desta análise foi o de se investigar diferenças entre as cepas correlacionando-as à forma clínica. Preparações contendo proteínas de membranas, proteínas solúveis (citosol) e lisados de cada cepa foram empregados na eletroforese das proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), na análise de glicoproteínas pela técnica de Con A blot, na análise antigênica pela técnica de "lmmunoblottinç" e na análise da atividade proteolítica em gel de poliacrilamida copolimerizado com.gelatina. Na análise do perfil eletroforético os padrões de bandas de proteínas das cepas BTU-10 e BTU-11 foram complexos e na maior parte homogêneos; algumas diferenças foram detectadas entre as proteínas de membranas. Várias glicoproteínas foram demonstradas, destacando-se as de 81,72, 59 kDa e a glicoproteína de 62 kDa, detectadas nas preparações de proteínas de membranas e proteínas solúveis, respectivamente. Entre estas glicoproteínas, a de 81 kDa foi detectada apenas entre as proteínas de membranas das cepas BTU-11 e P-1, isoladas de casos sintomáticos. Vários componentes antigênicos foram reconhecidos por anticorpos IgG de coelho pela técnica de "Immunoblotting". Entre estes componentes, as proteínas de 32 kDa, entre as proteínas de membranas e a de 30 kDa, entre as proteínas solúveis, parecem tratar-se de proteínas já caracterizadas como "Giardinas". Antígenos reconhecidos por IgG humana foram identificados apenas entre as proteínas de membranas, destacando-se as bandas de 64,62, 58, 52 e 47 kDa...

In the present investigation, we analysed the biochemical and antigenic characteristics of two axenic strains of Giardia duodenalis, isolated from a symptomatic (BTU-11) and an asymptomatic patient (BTU-10), in the Campus of Botucatu, UNESP. The axenic strain Portland 1 (P-1), isolated in the United States, was used as a reference strain. We aimed at detecting differences between the strains and to correlate them with the clinical presentation. Fractions containing membrane proteins or soluble proteins (cytosol proteins), and Iysates from each strain were tested in sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for the pattern of proteins, in concanavalin-A blotting for the profile of glycoproteins and in pólyacrylamide gel co-polymerized with gelatin for evaluation of the proteolytic activity. Both Botucatu strains showed a complex and homogeneous electrophoretic pattern of proteins with some differences among membrane proteins. Several glycoproteins (gp) were detected, particularly gp81, 72, 59 kDa and gp62 in the membrane proteins and cytosol proteins, respectively. Gp 81 was demonstrated only in the membrane proteins of the BTU-11 and P-1 strains from symptomatic patients. Many antigenic components were reavealed by anti-Giardia rabbit IgG antibodies in the immunoblotting analysis. Among these components, the membrane protein p32 and cytosol protein p30 corresponded to giardin, as previously demonstrated...

Detección de antígeno de Giardia en materia fecal de Meriones unguiculatus (Gerbil) por ELISA utilizando anticuerpos policlonales / Detection of Giardia antigen in Meriones unguiculatus (Gerbil) faeces by ELISA using policlonal antibodies

La identificación de Giardia lamblia en heces puede fracasar debido a la eliminación intermitente de quiste y/o trofozoítos del parásito. Actualmente, puede recurrirse a la detección de antígeno del parásito en materia fecal comprobando que el huésped está infectado y/o enfermo circunstancia que ofrece una gran ventaja para el tratamiento oportuno de paciente y de manera indirecta para el control de la enfermedad de las personas que se encuentran alredodor de éste. En este trabajo, se estandarizó y evaluó el ensayo inmunoenzimático ELISA utilizando anticuerpos policlonales anti-quiste y antitrofozoíto de cepas colombianas de Giardia desarrollados en conejo para la detección de antígeno del parásito en heces de gerbils (Meriones unguiculatus), modelo animal para estudios de giardiasis, como paso previo para la detección de antígeno en heces humanas. Para ello, se purificaron quistes de Giardia a partir de heces humanas mediante gradientes de sucrusa y percoll para infectar gerbils y obtener periódicamente quistes y trofozoítos del parásito. Posteriormente con la finalidad de obtener anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-trofozoítos del parásito, se inocularon conejos independientemente con antígeno de quiste y trofozoíto de Giardia. Se realizó una mezcla de anticuerpos policlonales anti-quiste y anti-trofozoíto de Giardia, en una proporción 1:2 respectivamente, previa purificación de éstos mediante precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato de amonio y se eleboró un conjugado con parte de los anticuerpos policlonales uniéndole a éstos fosfatasa alcalina. Finalmente se realizó el diagnóstico parasitológico a 47 heces de gerbils infectados previamente con quistes de giardia y 55 heces de gerbils no infectados. Se observó quistes de Giardia en las 47 heces de gerbils infectados (muestras positivas) y ningún parásito intestinal en los animales no infectados (muestra negativas). La concentración óptima de anticuerpos policlonales fue de 40 µgr/ml y la dilución óptima de conjugado fue de 1:400. El valor de absorbancia (punto de corte) que diferenció una muestra negativa de una positiva fue de 0.142. Los parámetros de la prueba fueron: sensibilidad: 91 por ciento, especificidad: 93 por ciento, valor predictivo positivo: 91 por ciento y valor predictivo negativo: 93 por ciento. El ELISA estandarizado y evaluado servirá como base para la detección de antígeno de Giardia en heces humanas

Evaluación de la respuesta de anticuerpos en pacientes con giardiasis / Assessment of antibody response in patients with giardiassis

Se estudiaron 104 pacietnes con sintomatología clínica compatible con una giardiasis, de éstos, 101 resultaron parasitológicamente positivos. La presencia de anticuerpos fue demostrada en 99 de ellos, para una sensibilidad de la técnica de inmunofluorescencia indirecta de 96 por ciento y una especificidad de 90 por ciento . La respuesta de anticuerpos fue significativamente mayor (p<0,01) en aquellos pacientes sin antecedentes de la enfermedad, se observó una caída significativa (p<0,01) de los títulos de anticuerpos en todos los pacientes 1 mes posterior al tratamiento eefectivo y la persistencia de títulos positivos en aquéllos que no curan

Inmunoterapia con extracto de giardia lamblia en la urticaria crònica recidivante sensibilizada / Immunotherapy with Giardia lamblia extract in recurrent chronic sentized urticaria

Se estudiaron 100 pacientes diagnosticados de urticaria crónica de causa parasitaria a Giardia lambia. Se reealizaron investigaciones en heces fecales seriadas , drenaje biliar , frotis duodenal, dosificasión de inmunoglobulinas séricas G, M,a y E; además de pruebas de lectura inmediata con un extracto de Giardia lambia al 1, 10, y 100 UNP. Se encontró 93% de mejoria clínica con la utilización de la inmunoterapia específica.

Characterization of surface associated antigens of axenic Giardia lamblia trophozoites & their recognition by human sera.

Two surface associated antigens (GLSA-82 and GLSA-56) of axenically grown G. lamblia trophozoites (PI strain) were affinity purified from its sonic extract. Both GLSA-82 and GLSA-56 were heat labile, sensitive to treatment with pronase, trypsin and were also sodium metaperiodate modifiable as assessed by micro ELISA. Lectin binding studies revealed that GLSA-82 specifically bound concanavalin A and pokeweed mitogen, and had alpha-methyl mannoside and n-acetyl-B-d-glucosamine sugar moieties. However, GLSA-56 selectively bound Ricinus communis agglutinin and phytohaemagglutinin, and had B-d-galactose and n-acetyl-B-d-galastosamine as sugar moieties. Human sera obtained during acute G. lamblia infection recognised GLSA-82 and GLSA-56 antigens. However, the antibody levels to GLSA-82 were significantly lower (P less than 0.05) during active giardiasis infection. Such surface associated antigens may be target of antiparasitic immune responses and thus, may modulate disease processes.

A comparative study of four methods for detecting antibody in asymptomatic giardiasis.

Four immunological methods for diagnosis of giardiasis comprising complement fixation (CF) test, indirect hemagglutination (IHA) test, enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) and lectin immuno test (LIT) were studied. Fifty sera from asymptomatic giardiasis patients, 40 from patients with other diseases and 50 from healthy controls were evaluated. The seropositive rates in asymptomatic giardiasis were 36% for CF, 58% for LIT, 30% for IHA and 72% for ELISA. The seropositive rates in patients with other diseases were 22.5% for CF, 52.5% for LIT, 12.5% for IHA and 67.5% for ELISA. The results suggest that the test of choice for giardiasis was CF with 88% specificity, nevertheless this test showed low sensitivity (36%). Other two tests, ELISA and LIT were more sensitive than CF with percent sensitivity of 72 and 58 respectively, but these two tests had severe disadvantages in being less specific with percentage specificity of 48 and 60 respectively.

A simple ELISA for antigiardial antibody using the membrane fraction of the parasite as antigen.

Most existing methods for detecting antigiardia lamblia antibody require the use of cultured Giardia lamblia trophozoites as antigen in immunofluorescent and enzyme-linked immunosorbent assays. However, the maintenance of trophozoite culture systems limits the large-scale use of these antibody detection systems. An antigen extracted from Giardia lamblia by the detergent Triton X-100, when used in an ELISA system, produces specific, objective, quantitative and reproducible results. It is likely that such a test system could be packaged in kit form for large-scale diagnostic and epidemiological application in all parts of the world.