Caracterização de aspectos geneticos e imunologicos envolvidos no desenvolvimento de inibidores em hemofilia A e B / Genetic and immunologic aspects related to the development of inhibitors in hemophilia A and B

Uma complicação decorrente do tratamento da hemofilia é a formação de anticorpos neutralizadores da atividade coagulante do fator VIII ou IX (inibidores). Diversos fatores estão relacionados com o desenvolvimento desses inibidores em indivíduos com hemofilia, incluindo fatores genéticos e ambientais. Entre os fatores genéticos, a mutação associada ao diagnóstico da hemofilia é um fator de risco bem documentado. Recentemente foi observada a maior ocorrência de inibidores em indivíduos da etnia negra. O objetivo deste trabalho foi analisar os aspectos genéticos e não genéticos envolvidos no desenvolvimento de inibidores. Foram incluídos nesse estudo 411 pacientes hemofílicos, sendo 321 com hemofilia A (HA) (238 famílias) e 99 com hemofilia B (HB) (59 famílias). A presença de inibidores foi constatada apenas entre os pacientes HA graves. Do total de 220 HA graves desse estudo, 46 (20,9%) apresentaram inibidor detectado em pelo menos uma ocasião após sua inclusão no estudo. Mutações consideradas de alto-risco para o desenvolvimento de inibidores foram identificadas em 125/220 pacientes HA graves (58,8%), e 33 deles desenvolveram inibidores (26,4%). Considerando o grupo étnico de acordo com traços físicos e ancestralidade, 38% dos pacientes HA graves foram classificados como negros. A incidência de inibidores foi maior nesse grupo de pacientes (31% do total de pacientes HA graves classificados como negros) quando comparada aos pacientes caucasóides (20% do total de pacientes HA graves classificados como caucasóides). Recentemente, foi observado que a maior incidência de inibidores em uma população norte-americana de pacientes com HA, estava relacionada com a presença de determinados haplótipos no gene do fator VIII...

The most serious complication of the treatment of hemophilia is the development of neutralizing antibodies to coagulation activity of factor VIII or IX (inhibitors). Several risk factors are related to the development of these inhibitors in patients with hemophilia, including genetic and environmental factors. Among genetic factors, the mutation associated with the diagnosis of hemophilia is a risk factor well documented. Recently, it was observed a higher incidence of inhibitors in African ancestry patients. The aim of this study was to analyze the genetic and non-genetic factors involved in the development of inhibitors. The study included 411 hemophilia patients, of which 321 with hemophilia A (HA) and 99 with hemophilia B (HB), belonging to a total of 238 and 59 families, respectively. The inhibitors were observed only in severe HA patients. From the 220 severe HA, 46 (20.9%) had inhibitor. The high risk mutation for the development of inhibitors were identified in 125 / 220 (58.8 %) severe HA patients, and 33 (26.4 %) of them developed inhibitors. Considering the ethnic group according to physical traits and ancestry, 38 % of severe HA patients were classified as black. The incidence of inhibitors is higher in this group of patients (31%) when compared to Caucasian patients (20%). The higher risk of inhibitor among African-Brazilians, could not be explained by the presence of the distinct factor VIII haplotypes, such as H3 and H4, as suggested in previous study.

Polimorfismos intragénicos de los genes de los factores VIII y IX y su utilidad en el diagnóstico indirecto de portadoras de hemofilias A y B / Intragenic polymorphisms of factor VIII and IX genes and their utility in the indirect diagnosis of carriers of haemophilias A and B

Las Hemofilias A y B se consideran enfermedades hereditarias ligadas al sexo debidas a mutaciones en los genes que codifican para los factores VIII y IX respectivamente, ocasionando deficiencia en los niveles de la concentración plasmática de estas proteínas y cuyos roles son los de participar activamente en el mecanismo de la coagulación sanguínea. Se han reportado diversas mutaciones responsables de la alteración de estos genes; razón por la cual resulta poco práctico la aplicación de un método de diagnóstico molecular directo para la identificación de mujeres portadoras, por ello, una estrategia diagnóstica apropiada es el análisis indirecto de polimorfismos ligados al gen. El objetivo de este trabajo fue identificar mujeres portadoras en diversas familias con antecedentes de HA y HB residentes del estado Zulia, en Venezuela, caracterizando polimorfismos intragénicos de los genes del factor VIII y factor IX, los cuales permitieron asignar haplotipos y diagnosticar o descartar el estado portador al 95 por ciento de las mujeres que requerían el estudio para HA y al 100 por ciento para HB.

Haemophilia A and B are considered sex-linked inherited diseases caused by mutations in genes that encode factors VIII and IX, respectively. This results in the deficiency of these proteins plasma levels which are actively involved in the mechanism of blood coagulation. It has been reported that several mutations are responsible for the alteration of these genes, which is why the application of a molecular diagnostic method for the direct identification of female carriers is impractical. An appropriate diagnostic strategy is the indirect analysis of polymorphisms linked to the gene. The aim of this study was to identify female carriers in different families with history of HA and HB that live in Zulia State, Venezuela, characterizing intragenic gene polymorphisms of the clotting factors VIII and IX, which helped to identify and assign haplotypes, to diagnose or to exclude the carrying condition, to 95 percent of women who were needing the study for HA and to 100 percent for HB.

Estudio familiar de las hemofilias A y B: 5 años de experiencia en la detección de portadoras / Family study of hemophilia A and B: 5 years of experience in carrier detection

La hemofilia se caracteriza por ser una enfermedad congénita del trastorno de la coagulación y constituye un desorden recesivo ligado al cromosoma X. El estudio molecular se realiza por estudios indirectos por ser causada por mutaciones heterogéneas en los genes del FVIII y FIX. Se realizó el estudio de 40 familias afectadas con hemofilia A (HA) y 10 hemofilia B (HB). La extracción de ADN se realizó por el método de precipitación salina a 293 muestras de sangre y 19 de líquido amniótico, y se hizo el análisis de los polimorfismos St14, Bcl I y Hind III para la HA y Taq I, Xmn I y Dde I para la HB. Se usó la técnica de PCR. En el caso de la HA se obtuvo el 35 por ciento de informatividad para St14 y Hind III y 32,5 para Bcl 1. El polimorfismo Dde I fue el más informativo para la HB con el 33 por ciento; mientras que Taq I representó el 10 por ciento de informatividad y XmnI el 0 por ciento. Se comprobó que de las 40 familias analizadas con HA, 23 fueron informativas. Por otra parte, fueron informativas 4 familias de las afectadas con HB. Se realizaron 19 diagnósticos prenatales con previa determinación del sexo fetal, incluidos 3 varones enfermos

Hemophilia is a congenital disease of coagulation disorder and it is a recessive disorder linked to X-chromosome. The molecular study is conducted by indirect studies due to it is caused by heterogeneous mutations in gen of FVIII and FIX in 40 families with hemophilia A (HA) and 10 with hemophilia B (HB). DNA extraction was carried out by saline precipitation method in 293 blood samples and 19 samples of amniotic fluid, as well as the analysis of St14, Bcl I and Hind III polymorphism for the AH and Taq I, Xmn I and Dde I for BH. The PCR technique was used. In the caser of AH it was possible to achieve a 35 percent of information for St14 and Hind III and a 32.5 percent for Bcl. Dde polymorphism supplied more information for BH for a 33 percent; whereas the Taq I represented the 10 percent of information and Xmn I the 0 percent. We verified that from the families analyzed with HA, in 23 of them we there was information. Besides, in 4 families affected by HB there was information. A total of 19 prenatal diagnoses were made with a previous determination of fetus sex, including 3 males ill

Genética de la hemofilia humana. Diagnóstico molecular de defectos en los genes de los factores VIII y IX de coagulación / Genetics of human haemophilia. Molecular diagnosis of defects affecting coagulation factors VIII and IX

La hemofilia A (HA) y B (HB) son enfermedades hemorrágicas hereditarias ligadas al sexo causadas por defectos de los factores VIII y IX, respectivamente. Excepto grandes inversiones recurrentes involucradas en la mitad de las HA severas, el resto de las hemofilias son causadas por distintos tipos de mutaciones grandes y pequeñas. Fueron estudiadas 70 familias con HA severa (se), 6 con seHB, 1 con HA moderada-leve (m) y 2 con mHB. Primero, en seHA, se estudio la inversión del intrón 22 (Inv22) usando un nuevo abordaje basado en PCR inversa. En los casos negativos para las inversiones se estudiaron primariamente las grandes deleciones y secundariamente las mutaciones pequeñas. En familias con HA, encontramos la Inv22 en 43 por ciento de las seHAs, una única inversión del intrón 1, 10 grandes deleciones (catorce por ciento)y 23 mutaciones pequeñas (incluyendo 10 deleciones, 3 inserciones, 4 cambios nonsense, 5 missense y 1 de splicing); y en HB, 1 deleción afectando un sitio de splicing, 4 missense y 3 nonsense. Este esquema de caracterización de mutaciones permite un estudio y análisis molecular preciso de HA y HB y beneficiará tanto al asesoramiento genético como a la provisión de información clave para el diseño del tratamiento.

Molecular diagnosis of hemophilia A and B. Report of five families from Costa Rica

Hemophilia A and B are X-chromosome linked bleeding disorders caused by deficiency of the respective coagulation factor VIII and IX. Affected individuals develop a variable phenotype of hemorrhage caused by a broad range of mutations within the Factor VIII or Factor IX gene. Here, were report the results of the molecular diagnosis in a five Costa Rican families affected with Hemophilia. Methods of indirect and direct molecular diagnosis are applied in three Hemophilia A and two Hemophilia B families from Costa Rica as well as preconditions, practicability and facilities of this diagnosis. In two families with Hemophilia A and both families with Hemophilia B the causative mutation could be detected by Southern blotting, polymerase chain reaction or sequence analysis. One Hemophilia A family could only analyzed by linkage analysis using genomic markers.

DNA polymorphisms for carrier detection of hemophilia in Thailand.

The assessment of carrier state based on the pedigree and laboratory testing in 55 females from 34 Thai hemophilia families (24 affected by hemophilia A, 10 by hemophilia B) was studied. The laboratory testing included phenotypic analysis (FVIII:C/vWF: Ag ratio, FIX:C) and two types of DNA polymorphisms, restriction fragment length polymorphisms (RFLP) and variable number tandem repeats (VNTR) in/and close to the factor VIII genes (Bcl I, Xba I RFLP, St 14 VNTR) and factor IX genes (Mse I, Dde I RFLP). Fifteen out of seventeen (88%) obligate hemophilia A carriers and one out of five (20%) obligate hemophilia B carriers were diagnosed by phenotypic analysis. All hemophilia A carriers were informative for at least one polymorphism (Bcl I, Xba I or St 14) while 42% of hemophilia B carriers were informative for Mse I RFLP only. DNA polymorphism analysis has advantage over phenotypic analysis since it generally gives an absolute diagnosis when informative. Most DNA polymorphism analyses are performed by PCR technique which is a simple, inexpensive and quick procedure. However, it is limited by non-informativeness and high incidence of new mutations.

Molecular analysis of hemophilia B in Brazilian patients

1. The molecular basis of hemophilia B was investigated in 19 Brazilian patients from 14 unrelated families. 2. Southern blotting of TaqI-digested DNA samples was employed for the screening of gene lesions followed by polymerase chain reaction and DNA sequencing for the characterization of mutations. 3. Three different gene mutations were characterized: a nonsense mutation at nucleotide 30875 (codon 252, CGA-->TGA), a partial deletion comprising exons 1-3 (at least 7.4 kb of extension), and a complete deletion (at least 42 kb of extension). These patients are now referred to as Ribeir ao Preto 1, Ribeir ao Preto 2 and Ribeir ao Preto 3, respectively. 4. The factor IX haplotype (composed of 7 polymorphic sites) associated with each mutation was determined. Comparisons with previous studies confirmed an independent origin for the nonsense mutation. 5. This study represents the first survey of gene lesions associated with hemophilia B in South America. The results indicate the presence of heterogeneous mutations, as observed in other populations. These results also contribute to the understanding of the mechanisms involved in the mutations affecting the FIX gene

Genética molecular de la hemofilia A y B: diagnóstico prenatal y de portadoras / Molecular genetics of hemophilia A and B: prenatal and of female carrier diagnosis

En los últimos años y mediante el uso de la tecnología del ADN recombinante, ha sido posible clonar y determinar la estructura de los genes para los factores VIII y IX de la coagulación. En la actualidad, se conoce que el gen del factor VIII tiene una extensión de 186 kb y está dividido en 26 exones, mientras que el gen del factor IX comprende 34 kb divididos en 8 exones. Los avances en el conocimiento de estos genes han permitido comenzar a comprender las bases moleculares de estas enfermedades; además, han hecho posible el desarrollo de técnicas para realizar el diagnóstico prenatal y de portadores de ambas hemofilias, lo que permite garantizar una descendencia sana en las familias afectadas y constituye una medida importante en la prevención de estas enfermedades

Detection of Christmas disease (hemophilia B) carriers

O fator IX (FIX) é uma glicoproteina plasmática que participa no processo de coagulaçäo sangüínea. A deficiência congênita de FIX causa a doença de Christmas, uma condiçäo genética devida à presença de um gene recessivo ligado ao cromossomo X. Os níveis de atividade coagulante de FIX (FIXc) e de atividade antigênica (FIXAg) foram medidos pela técnica de dois estágios e por imunoeletroforese respectivamente, em 26 mulheres saudáveis e em 61 portadoras certas de doença de Christmas. Os resultados dessas medidas foram utilizados para análise discriminante e uma fórmula foi obtida para calcular a probabilidade de heterozigose de 59 portadoras prováveis. Tanto os níveis de atividade coagulante, como os níveis de atividade antigênica, idade e dados genealógicos se revelaram importantes na detecçäo de portadoras. Na amostra de portadoras prováveis contendo filhas de portadoras certas, 24% das mulheres testadas mostraram uma probabilidade de heterozigose maior que 50%. Isto se deve, provavelmente, em parte ao acaso e em parte à inativaçäo de mais de 50% dos cromossomos X contendo o alelo para doença de Christmas em algumas portadoras. Observou-se uma freqüência alta (71%) de portadoras entre as mäes de casos isoladas de doença de Christmas e isso corrobora a afirmaçäo de Simpson e Biggs (1962) de que o suprimento de genes para doença de Christmas numa dada geraçäo ase origina mais frequentemente dos ancestrais do que por mutaçäo

Estimation of genetic risks of carriership for possible carriers of Christmas disease (hemophilia B)

Hemofilia B ou doença de Christmas é uma anomalia genética causada pela deficiência congênita de fator IX (FIX) e apresenta padräo de herança recessivo ligado ao cromossomo X. O risco de recorrência para a mäe ou irmä de um caso isolado de hemofilia B depende da incidência de heterozigotas na populaçäo em geral, a qual pode ser obtida se a taxa de mutaçäo (u) do gene para hemofilia B e o valor reprodutivo dos afetados forem conhecidos. O método indireto de Haldane foi utilizado para o cálculo de u, com a fórmula: u = 1/3 (1-f) p, sendo f o valor reprodutivo dos homens afetados e p a proporçäo de homens afetados na populaçäo. A fertilidade encontrada para esses indivíduos, em comparaçäo com aquela da populaçäo normal da Inglaterra foi de 0,53. A proporçäo de hemofílicos B (p) foi calculada dividindo-se o número de pacientes com níveis de FIX < 10%, cadastrados em todos os centros de hemofilia da Inglaterra e vivos em 1982; pelo número de homens normais daquela populaçäo. O número obtido foi 2 x 10**-5. A taxa de mutaçäo por cromossomo, por geraçäo, calculada para o gene de Hemofilia B foi de 0,31 x 10**-5. A incidência de portadoras de Hemofilia B na populaçäo foi calculada em 3,4 x 10**-5, através da fórmula: h = 4u + 2 pf. Utilizando essas informaçöes, a probabilidade de heterozigose para mäes de casos isolados de Hemofilia B foi calculada em 0,83, e para irmäs de casos isolados em 0,41. Esses resultados estäo de acordo com a afirmaçäo de Simpson e Biggs (1962) de que os genes para Hemofilia B aparecem numa geraçäo mais frequentemente através da transmissäo pelos ancestrais do que através de mutaçäo