Purification of a protease inhibitor from Dolichos biflorus using immobilized metal affinity chromatography.

Plant protease inhibitors (PIs) are generally small proteins which play key roles in regulation of endogenous proteases and may exhibit antifeedant, antifungal, antitumor and cytokine inducing activities. Dolichos biflorus (horse gram) is an unexploited legume, which is rich in nutrients and also has therapeutic importance. It contains a double-headed PI, which is an anti-nutritional factor. As there is no report available on its simultaneous removal and purification in single step, in this study, a double-headed PI active against both trypsin and chymotrypsin was purified from Dolichos biflorus to ~14-fold with ~84% recovery using an immobilized metal affinity chromatography (IMAC) medium consisting of Zn-alginate beads. The method was single-step, fast, simple, reliable and economical. The purified inhibitor showed a single band on SDS-PAGE corresponding to molecular mass of 16 kDa and was stable over a pH range of 2.0-12.0 and up to a temperature of 100°C for 20 min. The optimum temperature for trypsin and chymotrypsin inhibitor was observed to be 50°C and 37°C, respectively and pH optimum was pH 7.0 and 8.0, respectively. Thus, IMAC using Zn-alginate beads was useful in simultaneous purification and removal of an anti-nutritional factor from horse gram flour in single step. This procedure may also be employed for purification of other plant PIs in one step.

Action of plant proteinase inhibitors on enzymes of physiopathological importance

Obtained from leguminous seeds, various plant proteins inhibit animal proteinases, including human, and can be considered for the development of compounds with biological activity. Inhibitors from the Bowman-Birk and plant Kunitz-type family have been characterized by proteinase specificity, primary structure and reactive site. Our group mostly studies the genus Bauhinia, mainly the species bauhinioides, rufa, ungulata and variegata. In some species, more than one inhibitor was characterized, exhibiting different properties. Although proteins from this group share high structural similarity, they present differences in proteinase inhibition, explored in studies using diverse biological models.

Obtidas de sementes leguminosas, várias proteínas inibem proteinases de origem animal, incluindo humanas, e podem ser consideradas para o desenvolvimento de compostos com atividade biológica. Inibidores da família Bowman-Birk e da família Kunitz vegetal tem sido caracterizados em relação a especificidade para proteinase, estrutura primária e sitio reativo. O nosso grupo majoritariamente vem estudando o gênero Bauhinia, principalmente as espécies bauhinioides, rufa, ungulatae variegata. Em algumas espécies, mais de um inibidor com propriedades diferentes foi caracterizado. Embora tais proteínas apresentem alta similaridade estrutural, diferem quanto à inibição de proteinases, e foram exploradas em estudos utilizando diversos modelos biológicos.

Enfermedad hepática por déficit de alfa-1-antitripsina en un lactante / Hepatic disease by alpha-1-antitrypsin deficiency in an infant

El déficit de AAT es una condición genéticamente determinada, que en casuísticas extranjeras explica hasta 30% de los casos de hiperbilirrubinemia de predominio directo en el primer semestre de vida, y constituye una causa no despreciable de enfermedad hepática en niños mayores, incluyendo cirrosis. Se describe, por primera vez en nuestro país, el caso confirmado de un lactante con enfermedad hepática por déficit de AAT, que se presentó en forma de colestasia neonatal. Su estudio descartó causas infecciosas, tóxicas, metabólicas, familiares y atresia de vías biliares. Esta enfermedad debe ser excluida en cualquier lactante o niño con alguna forma de enfermedad hepática, siendo la biopsia hepática altamente sugerente al detectar gránulos PAS positivos, diastasa resistentes; sin embargo, la medición de alfa antitripsina en el suero -en ausencia de la curva correspondiente a las alfa-2-globulinas en la electroforesis de proteínas- y la determinación del fenotipo confieren certeza al diagnóstico. Promisorias líneas de investigación permitirían contar con medios terapéuticos específicos

Identificación y caracterización inicial de una proteasa de inmunoglobulina A asociada a espermatozoides humanos / Identification and characterization of a protease of immunoglobulin A associated to human spermatozzon

Los factores que el semen humano emplea para bloquear la respuesta inmune humoral a nivel del cuello uterino no se conocen. Esta respuesta está representada principalmente por la inmunoglulina A de tipo secretor (IgAs). Un mecanismo posible sería la hidrolisis de IgAs en forma análoga como ha sido descrito para algunas bacterias patógenas que colonizan los epitelios humanos e hidrolizan a la IgAs. El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de una proteasa para IgAs en semen humano, plasma seminal y espermatozoides empleando inmunoelectroforesis en agarosa y electroforesis en poliacrilamida realizando posteriormente inmunotransferencia en membrana de nitrocelulosa. Fue posible identificar una proteasa en la fracción espermática, que hidróliza a IgAs, produciendo dos fragmentos, el primero con peso molecular entre 66 y 70 kd, el segundo con peso molecular entre 40 y 45 kD. Su actividad enzimática fue óptima a las 24 horas, ph 7.5 a 37 grados C. Se trata de ima ,etañp'rpteasa (inhibida por EDTA). Su actividad fue específica para IgAs, no afectando otras inmunoglobulinas (IgGeIgM). La actividad enzimática del espermatozoide demostrada en este estudio, puede ser uno de factores necesarios empleados para bloquear la respuesta inmune humoral en el aparato genital femenino y permitir al al espermatozoide lograr la fecundación del ovocito humano.

Purificación parcial de una tóxina hemolítica y un inhibidor de proteasas a partir de la anemona de mar stoichactis helianthus / Partial purification of a hemolytic toxin and a protease inhibitor from stoichactis helianthus a sea anemona

La obtención de sustancias de origen natural con algún tipo de actividad biológica en células completas o membranas, ha sido motivo de la atención de muchos investigadores, los invertebrados marinos son una fuente de obtención de este tipo de sustancias. En este reporte se describe la purificación parcial de una toxina hemolítica de peso molecular de 11 000 y de un inhibidor de proteasas de peso molecular 4 000, obtenidos a partir de la anémona de mar Stoichactis helianthus. Se determinó la termoestabilidad de ambas sustancias, así como el efecto tóxico la membrana celular de la tóxina hemolítica, lo que hace que sea interesante para la construcción de moléculas híbridas por su unión covalente a anticuerpos y factores de crecimiento; no es así para el inhibidor de proteasa cuya estabilidad constituye una limitante

Serine and SH-proteinase inhibitors from Enterolobium contortisiliquum beans: purification and preliminary characterization

Two types inhibitors were prufied from Enterolobium contortisiliquum beans. The inhibitor of serine-proteinases inhibited trypasin (Ki = 5 nM) chymostrypsin (Ki = 10 nM) and plasma kallikrein, but not tissue kallikreins. The molecular weight is approximately 23 KDal and two polypeptide chains detected after reduction. The second inhibitor with activity directed against SH-proteinase was isolated by CM-papain-Sepharose. The molecular weight is approximately 60 KDal and only one polupeptide chain was detected after reduction. Papain (Ki = 0.6 nM) and bromelain are inhibited