Estudo da interação entre neutrófilos, células dendríticas humanas e L. braziliensis / Study of the interaction between neutrophils, human dendritic cells and L. braziliensis

Os neutrófilos são essenciais para a resposta imune inata contra uma variedade de patógenos. Eles são capazes de modular a resposta imune através da produção de citocinas e quimiocinas, degranulação e a sua interação direta com outras células no local da infecção, tais como as células dendríticas. A interação entre as células do sistema imune inato é essencial para direcionar a resposta imune adaptativa, a qual é responsável pela eliminação de microrganismos e manutenção de memória imunológica. Objetivo: Este estudo avaliou a interação de neutrófilos humanos com Leishmania braziliensis, através da análise da expressão de moléculas de superfície, liberação de enzimas presentes nos grânulos e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Também foi avaliada a interação entre neutrófilos humanos infectados e células dendríticas, a fim de se observar o efeito desta interação na indução da ativação das células dendríticas. Metodologia: Os neutrófilos foram purificados a partir do sangue periférico de doadores saudáveis e as células dendríticas foram geradas in vitro. Os neutrófilos foram infectados ou não com L. braziliensis e co-cultivados com as células dendríticas. Em seguida, os sobrenadantes e as células foram coletadas para avaliar a liberação de enzimas, tais como mieloperoxidase (MPO) e metaloproteinase 9 (MMP-9). O fenótipo e a função dos neutrófilos foram analisados através da expressão de Mac-1 (CD18 e CD11b), CD16, CD62-L e produção de ROS...

Neutrophils are essential in the innate immune response against a variety of pathogens. They are able to modulate immune response by cytokine and chemokine production, release of granules and their direct interaction with other cells at the infection site. Dendritic cells are recruited in response to cytokines and chemokines produced by neutrophils. The interaction between cells of the innate immune system is essential for targeting the adaptive immune response, which is responsible for eliminating microorganisms and the maintenance of immunological memory. Objective: Evaluate the interaction of human neutrophils with Leishmania braziliensis, through the analysis of surface molecule expression, release of granules enzymes and production of reactive oxygen species (ROS). We also evaluated the interaction between human infected neutrophils and dendritic cells, in order to observe the effect of this interaction on dendritic cells. Methodology: Neutrophils were purified from peripheral blood of healthy donors and dendritic cells were generated in vitro. Neutrophils were infected or not with L. braziliensis and cocultured with DC. Afterwards, supernatants and cells were harvested to evaluate the release of granules enzymes, such as myeloperoxidase (MPO) and metalloproteinase 9 (MMP-9). Neutrophils phenotype and function were analyzed by the expression of Mac-1 (CD18 and CD11b), CD16 and ROS production...

Avaliação da capacidade protetora de antígenos recombinantes contra a Leishmaniose Tegumentar / Protective capacity of recombinant antigens against tegumentary leishmaniasis

A leishmaniose é uma doença de escala global, que afeta 12 milhões de pessoas e pode causar um espectro de doenças que vai desde a forma cutânea localizada, que tende para a cura espontânea, até a forma visceral que é fatal. Apesar da gravidade da doença, até o momento não existe uma vacina efetiva para prevenir a leishmaniose. Dentre os antígenos promissores para o desenvolvimento de uma vacina, destacam-se as proteínas ribossomais (S4, S6, L3 e L5) e a KMP-11, uma proteína de superfície presente nos membros da família tripanosomatidae. Nosso estudo consistiu em avaliar os efeitos da imunização com estes antígenos frente ao desafio com L. major e com L. braziliensis, empregando modelos experimentais de infecção. Primeiramente, avaliamos a capacidade protetora dos antígenos ribossomais frente à infecção por L. major. Dos quatro antígenos avaliados, apenas L3 ou L5 foram capazes de prevenir o desenvolvimento da lesão e de diminuir a carga parasitária. A vacinação de camundongos com estes antígenos, na presença de CpG, induziu um perfil de resposta Th1, com elevada produção de IFN-γ, baixa produção de IL-10 e presença de anticorpos IgG2a. Em seguida, avaliamos a capacidade protetora dos antígenos L3 e L5...

Leishmaniasis is a global disease affecting 12 million people and can cause diseases that range from self-healing localized cutaneous leishmaniasis to fatal visceral leishmaniasis. Despite the severity of the disease, there is no effective vaccine to prevent leishmaniasis. Among the promising antigens for the development of a vaccine, stand out the ribosomal proteins (S4, S6, L3, and L5) and KMP-11, a surface protein, widely found in the members of family Trypanosomatidae. Our study evaluated the effects of immunization with these antigens upon challenge with L. major and L. braziliensis, employing the experimental models of infection. First, we evaluated the protective ability of ribosomal antigens to infection by L. major. Among the four antigens examined only L3 or L5...

Detección de Leishmania braziliensis en lesión mucosa con 16 años de evolución: Registro de un caso / Detection of Leishmania braziliensis in a mucosal lesion with 16 years of evolution: A case report

Se registra, en un paciente masculino de 48 años, la detección de Leishmania (Viannia) braziliensis en muestra de lesión mucosa crónica con 16 años de evolución clínica. El caso presentado cursa con perforación del tabique nasal no evidenciándose lesión cutánea primaria sugestiva de leishmaniasis. Por su ocupación el paciente ha frecuentado, por largos períodos, bosques en áreas endémicas para leishmaniasis en el occidente de Venezuela. Continuas evaluaciones clínicas, inmunológicas e histopatológicas realizadas durante varios años fallaron en establecer un diagnóstico certero incrementando la severidad del caso. Exámenes recientes realizados en nuestro laboratorio revelan la presencia de amastigotes en muestras de la lesión nasal activa en extendidos coloreados con tinción de Giemsa. La identificación del parásito como L. braziliensis y la verificación de la infección por este parásito en el paciente, fue lograda por ensayos de PCR y Western Blot, respectivamente. Se concluye que el caso presentado sufre una leishmaniasis mucocutánea de vieja data con una baja respuesta inmunológica, a juzgar por la frecuente negatividad en pruebas de IDR y/o la detección de anticuerpos circulantes anti-Leishmania. Se discute sobre la imprecisión diagnóstica en el caso presentado y se advierte sobre el riesgo epidemiológico potencial de casos similares.

The detection of Leishmania (Viannia) braziliensis from a chronic mucosal lesion with 16 years of clinical evolution in a 48 years old male patient is reported. The patient showed destruction of the nasal septal cartilage with no evidence of primary leishmanial lesion. Due to his professional work he frequently visited areas of western Venezuela where leishmaniasis is endemic. Frequent clinical, immunologic and histopathologic evaluations carried out during several years failed to establish a right diagnosis, increasing the severity of the mucosal lesion. The finding of a sparse number of amastigotes in a sample from the mucosal lesion stained by Giemsa stain, suggested a mucosal infection by Leishmania. The identification of the parasite as L. braziliensis and the verification of the infection by this parasite in the reported case were carried out using a PCR assay and a Western Blot test, respectively. It is concluded that the patient was suffering a long-lasting, reluctant to heal and severe lesion with a low immunological response due to infection by L. braziliensis causing mucocutaneous leishmaniasis (MCL). The fail in the diagnosis of this particular case of MCL and the potential epidemiological risk in similar cases are discussed.

Lesion aspirate culture for the diagnosis and isolation of Leishmania spp. from patients with cutaneous leishmaniasis

The detection of Leishmania spp. in skin lesion aspirates, using a puncture technique, was evaluated in 76 patients with cutaneous leishmaniasis (CL) who were referred to a Leishmaniasis Reference Centre in Brazil. CL was defined based on skin lesions suggestive of the disease and on a positive result of the Montenegro skin test or Giemsa-stained imprints of biopsy fragments. The aspirates were cultured using a vacuum tube device containing culture medium and evaluated for the presence of Leishmania spp. The biphasic medium culture was examined once a week for three weeks. Promastigotes were observed in 53/76 (69.7 percent) cultures. Stained smears from 60 of the 76 patients were evaluated using PCR-RFLP to detect the conserved minicircle region of Leishmania spp. and to classify the parasite. Of these patients, 45 (75 percent) showed positive results in aspirate culture and 15 presented negative results. The PCR was positive in 80 percent (53/60) samples. The PCR-RFLP profile was determined in 49 samples, of which 45 (92 percent) showed a pattern compatible with Leishmania (Viannia) braziliensis. The aspirate culture is a sensitive and feasible method for diagnosing CL and may be routinely adopted by health services for L. (V.) braziliensis isolation and identification.

Leishmania (Viannia) braziliensis growth in vitro culture relies more on folic acid availability than Leihsmania (Leishmania) amazonensis

We compared the in vitro growth of promastigotes from two Leishmania species in TC-100 and Schneider media. Leishmania (Leishmania) amazonensis replication rates were similar in both tissue culture media and reached maximum rates by 48 h. In contrast Leishmania (Viannia) braziliensis growth was significantly greater in TC-100 but maximum rates were achieved by 96 h. Folic acid appears to be the limiting factor and supplementation of Schneider media with this nutrient improved L. (V.) braziliensis replication rates and decreased the time of maximum replication to 48 h.

Estudo morfológico da Glândula Salivar do Flebotomíneo Lutzomyia migonei (França, 1920), Vetor de Leishmania braziliensis (Vianna, 1911)

Os protozoários do gênero Leishmania ocasionam as leishmanioses que acometem milhões de pessoas inclusive no Brasil. Os vetores do parasita no Novo Mundo são os insetos do gênero Lutzomyia. O ciclo de vida da Leishmania inicia-se no vetor durante a ingestão da alimentação sanguínea do hospedeiro vertebrado infectado. A hematofagia do inseto evoluiu dentro de um cenário de grande diversidade fisiológica com a adaptação das substâncias salivares. Apesar da importância da saliva na hemostasia, e na infecção por Leishmania, como demonstrado mais recentemente, não existe um estudo detalhado da glândula salivar do inseto na literatura

Escolhemos estudar a glândula salivar de Lutzomyia migonei, uma espécie antropofílica vetor de L. braziliensis e suspeito de L. amazonensis. Utilizamos um novo método de dissecção, o qual permitiu estudar a morfologia da glândula através de técnicas convencionais e modernas. A metodologia introduzida neste projeto de tese permitiu a obtenção de resultados inéditos. A glândula salivar é composta de dois lobos semelhantes ligados entre si, caracterizando o órgão como tendo duas unidades secretoras. Os lobos possuem um epitélio glandular voltado para a cavidade secretora e apoiado numa lâmina basal. O marcador nuclear fluorescente revelou a glândula composta por um pequeno número de células. As observações ultra-estruturais pela microscopia eletrônica de transmissão permitiu reconhecer distintas sub-populações de células secretoras. As lectinas fluorescentes marcaram distintos açucares na composição das estruturas da glândula, e também confirmaram a presença de sub-populações. Em conclusão, foi desenvolvido um estudo morfológico original e detalhado da glândula salivar de um flebotomíneo, o L. migonei, um importante vetor de leishmaniose. Não obstante a saliva dos insetos hematófagos seja composta por várias substâncias, a glândula salivar é um órgão parconstituído por diferentes sub-populações de células produtoras da saliva.

Estudo morfológico da glândula salivar do Flebotomíneo Lutzomyia migonei (França, 1920), vetor de Leishmania braziliensis (Vianna, 1911) / Morphological study of the salivary glands of Lutzomyia Sand fly migonei (France, 1920), vector of Leishmania braziliensis (Vianna, 1911)

Os protozoários do gênero Leishmania ocasionam as leishmanioses que acometem milhões de pessoas inclusive no Brasil. Os vetores do parasita no Novo Mundo são os insetos do gênero Lutzomyia. O ciclo de vida da Leishmania inicia-se no vetor durante a ingestão da alimentação sanguínea do hospedeiro vertebrado infectado. A hematofagia do inseto evoluiu dentro de um cenário de grande diversidade fisiológica com a adaptação das substâncias salivares. Apesar da importância da saliva na hemostasia, e na infecção por Leishmania, como demonstrado mais recentemente, não existe um estudo detalhado da glândula salivar do inseto na literatura. Escolhemos estudar a glândula salivar de Lutzomyia migonei, uma espécie antropofílica vetor de L. braziliensis e suspeito de L. amazonensis. Utilizamos um novo método de dissecção, o qual permitiu estudar a morfologia da glândula através de técnicas convencionais e modernas. A metodologia introduzida neste projeto de tese permitiu a obtenção de resultados inéditos. A glândula salivar é composta de dois lobos semelhantes ligados entre si, caracterizando o órgão como tendo duas unidades secretoras. Os lobos possuem um epitélio glandular voltado para a cavidade secretora e apoiado numa lâmina basal. O marcador nuclear fluorescente revelou a glândula composta por um pequeno número de células. As observações ultra-estruturais pela microscopia eletrônica de transmissão permitiu reconhecer distintas sub-populações de células secretoras. As lectinas fluorescentes marcaram distintos açucares na composição das estruturas da glândula, e também confirmaram a presença de sub-populações. Em conclusão, foi desenvolvido um estudo morfológico original e detalhado da glândula salivar de um flebotomíneo, o L. migonei, um importante vetor de leishmaniose. Não obstante a saliva dos insetos hematófagos seja composta por várias substâncias, a glândula salivar é um órgão par constituído por diferentes sub-populações de células produtoras da saliva.

Glucantine resistant Leishmania promastigotes are sensitive to pentostam

Diferentes amostras de leishmania foram analisadas quanto à susceptibilidade in vitro ao pentostam - uma cepa de L. (V) braziliensis considerada sensível ao glucantine, três cepas (duas L. (V) braziliensis e uma L. (L) amazonensis) consideradas naturalmente resistentes ao glucantine, uma linhagem resitente (L. (V) guyanensis) selecionada in vitro pela exposiçäo em alta concentraçäo de droga. A elevada sensibilidade destas amostras em contraposiçäo à resistência observada para a glucantine sugere existir relaçäo entre a estrutura química e a atividade destes compostos. Estes dados indicam a necessidade de uma avaliaçäo comparativa de atividade clínica do pentostam e do glucantime no tratamento da leishamniose

Development of Leishmania (Viannia) braziliensis Vianna, 1911 in Lutzomyia intermedia (Lutz & Neiva, 1912) (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) under experimental conditions

The development of Leishmania (Viannia) braziliensis in experimentally infected Lutzomyia intermedia, showed colonization of the hindgut from 48h after the infective blood-meal, and the migration flagellates to the foregut, with a massive infection of the cardia at the 5th day post infection. Up to 10 days following the infective blood-meal, very few parasites were seen in the pharynx and cibarium. The role of L. intermedia as a vector of cutaneous leishmaniasis is discussed according to the estabilished criteria

Growth curves of Leishmania brasiliensis brasiliensis promastigotes and surface antigen expression before and after adaptation to schneider's Drosophila medium as assessed by anti-leishmania human sera

Promastigotas de Leismania braziliensis (MHom/BR/75/M2903) foram cultivadas em meio de Schneider de cultura de drosófilas. em um tipo de experiência as formas promastigotas já haviam sido previamente adaptadas ao meio por passagens consecutivas enquanto que no segundo as promastigotas foram cultivadas em meio bifásico e depois transferidas para o meio líquido. O crescimento foi mais abundante nas células já adaptadas ao meio de cultura; células degeneradas e mortas em pequenos números, estavam presentes desde o dia 5 para promastigotas adaptadas ao meio líqüido e desde o dia 3 para células recentemente adaptadas. A síntese de antígenos de superfície diferiu de acordo com o modo como as células eram cultivadas, como verificado pelo título de 5 soros de leishmaniose mucocutânea. O melhor período para a preparaçäo de antígenos de imunofluorescência foi considerado o dia 5 para promastigotas adaptadas ao meio de cultivo e o dia 3 para células recentemente adaptadas

Leishmaniasis: estudios in vitro de crecimiento y sensibilidad a drogas / Leishmaniasis: in vitro studies of growth and sensibility to drugs

Utilizando un metodo sencillo previamente desarrollado en nuestro laboratorio, hemos logrado infectar una linea celular continua de macrofagos humanos U937 con promastigotes de dos cepas de Leishmania brazilensis aisladas en Colombia. Estas cepas fueron ademas analizadas con pruebas de sensibilidad a Pentostam, allopurinol y allopurinol-ribosido. Este nuevo sistema sera de mucha utilidad en varios aspectos relacionados con la enfermedad y elimina de hecho las dificultades inherentes a otros sistemas in vitro.

Leishmaniasis in Bolivia: II. The involvement of Psychodopygus yucumensis and Psychodopygus llanosmartinsi in the selvatic transmission cycle of Leishmania braziliensis braziliensis in a lowland subandean region

Uma pesquisa epidemiológica sobre os vetores da leishmaniose tegumentar (do tipo espúndia) foi empreendida na regiäo do Alto Beni, na Bolívia, uma zona de contrafortes andinos no limite Este das baixas planícies amazônicas. O clima é tipicamente tropical úmido (15- de latitude Sul). As espécies de flebótomos antropofílicos foram amostradas em vinte estaçöes, todas na floresta. A importância das espécies do grupo Psychodopygus, já suspeitas como vetores na transmissäo da Leishmania do complexo braziliensis, foi comprovada por: 1) a agressividade e a variedade das espécies encontradas (83% das capturas e nove espécies); 2) a descoberta de uma nova espécie antropofílica, P. yucumensis e 3) o isolamento de uma amostra de Leishmania braziliensis braziliensis indistinguível das amostras humanas da mesma regiäo, de duas espécies, P. llanosmartinsi e P. yucumensis

Flebótomos de Vargem Grande, foco de leishmaniose tegumentar no Estado do Rio de Janeiro / Phlebotomus of Vargem Grande, focus of tegumentary leishmaniasis in the State of Rio de Janeiro

Realizamos durante um ano completo coletas sistemáticas de flebótomos em Vargem Grande, onde recentemente encontráramos Lutzomyia intermedia naturalmente infectada por Leishmania braziliensis. Capturamos flebótomos pertencentes a doze espécies. Tanto dentro de casa quanto no peridomicílio, as capturas em isca humana e com armadilha luminosa, revelaram a grande predominância de L. intermedia seguida de L. migonei. Na plantaçäo predominou L. migonei. Nas coletas simultâneas em homem e cäo, L. intermedia foi mais freqüente no primeiro e L. migonei no segundo