Microbiota intestinal y salud en humanos: obesidad y diabetes mellitus tipo 2 / Gut microbiota and healthy in human: obesity and type 2 diabetes mellitus

RESUMEN Introducción La cantidad y la diversidad bacteriana intestinal están relacionadas con las enfermedades metabólicas e inflamatorias. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la composición de la microbiota intestinal en heces y su relación con variables bioquímicas y el patrón de consumo de alimentos en individuos sanos, obesos y pacientes con diabetes mellitus tipo 2, en Mallorca (España). Métodos Las bacterias en heces se caracterizaron por PCR tiempo real. El ADN se aisló a partir de sujetos sanos (23), obesos (no diabéticos) (24) y diabéticos tipo 2 (no obesos) y se amplificó con cebadores específicos para identificar Roseburia, Clostridium leptum, Lactobacillus y Clostridium coccoides-Eubacterium rectale (Firmicutes); Prevotella y Bacteroides (Bacteroidetes); Bifidobacterium (Actinobacteria) y el cebador Universal (para total de bacterias), para la amplificación de la región V4 del gen 16S rRNA. Los resultados se analizaron estadísticamente utilizando SPSS v.21. Resultados En una población rural y urbana de Baleares, se detectaron niveles de insulina significativamente superiores en obesos (12,2 + 1,3 md/dL). En diabéticos, los niveles de triglicéridos, glucosa en sangre, hemoglobina glucosilada y albúmina en orina fueron superiores que en controles y obesos (por encima del rango normal). La mayor dispersión de las variables bioquímicas en sangre se identificó con: Clostridium coccoide-Eubacterium rectale, Bacteroides y Bifidobacterium, como posibles marcadores en obesos y diabéticos y Prevotella y Lactobacillus, como marcadores de salud. El contenido total de bacterias es mayor en controles y la relación entre reinos bacterianos es menor en este grupo. Los patrones de consumo de alimentos fueron diferentes en los tres grupos lo cual está relacionado con la variación en los patrones bacterianos. Conclusión La variabilidad en el consumo de alimentos estuvo relacionada con cinco marcadores bacterianos principales que contribuyeron a la mayor variabilidad de marcadores bioquímicos entre grupos de sujetos: Clostridium coccoide-Eubacterium rectale, Bacteroides, Bifidobacterium, Prevotella y Lactobacillus, en una población de Mallorca (España). Gut microbiota and healthy in human: obesity and type 2 diabetes mellitus.

ABSTRACT Introduction The amount and bacterial diversity in the bowel are associated to metabolic and inflammatory diseases. The aim was to characterize the gut microbiota composition in faeces and food consumption pattern in healthy, obese and Type 2 diabetes mellitus subjects from Majorca (Spain). Methods Bacteria in faeces were characterized by Real-time PCR. DNA was isolated from healthy subjects (23), obese patients (not diabetic) (24) and type 2 diabetic patients (12) and amplified with specific primers for the identification of Roseburia, Clostridium leptum, Lactobacillus and Clostridium coccoides-Eubacterium rectale (Firmicutes); Prevotella and Bacteroides (Bacteroidetes); Bifidobacterium (Actinobacteria); and Universal primer (for all bacteria), referred to amplification of 16S rRNA gene V4 region. Results were statistically analyzed by SPSS v.21. Results A rural and urban population from Balearic Islands was tested. The insulin levels were highest in obese group (12.2 + 1.3 md/dL) while the triglyceride, blood glucose, glycosylated haemoglobin and urine albumin levels were highest in diabetic group. The major dispersion of the blood variables was identified to a bacteria core: Clostridium coccoide-Eubacterium rectale, Bacteroides and Bifidobacterium as possible markers for obese and diabetic patients; and Prevotella and Lactobacillus levels as markers of health. The total amount of bacteria is the highest in control group, such as the ratio between phyla is the lowest. The food consumptiom patterns were different among which is related to the variation in the bacterial patterns. Conclusion The variability in the foods consumption among groups was related to five bacterial markers which contributed to the major variability in blood markers: Clostridium coccoide-Eubacterium rectale, Bacteroides, Bifidobacterium, Prevotella y Lactobacillus; in a population from Majorca, Spain.

Efeito de extratos orgânicos de variedades de cebola sobre o quorum sensing bacteriano / Effect of organic extracts of onion varieties on bacterial quorum sensing

Muitos genes bacterianos são regulados pelo mecanismo de comunicação denominado quorum sensing (QS). Neste sistema, moléculas sinalizadoras ativam um comportamento de grupo, conforme a densidade celular, permitindo o controle da expressão gênica. Estudos sugerem o potencial de compostos extraídos de plantas sobre o QS, a exemplo da quercetina, um flavonol presente em concentrações elevadas em algumas frutas e hortaliças. Este composto é o flavonoide majoritário presente em cebola (Allium cepa), mas não existem estudos que mostrem a atividade anti-QS de extratos orgânicos deste vegetal. Este trabalho avaliou o potencial antimicrobiano e anti-QS de extratos orgânicos de cebola branca e cebola roxa, assim como de alguns de seus componentes majoritários identificados, em fenótipos regulados pelo QS como a produção de violaceína em Chrormobacterium violaceum ATCC 12472, a motilidade tipo swarming e a formação de biofilmes em Pseudomonas aeruginosa PAO1 e Serratia marcescens MG1. Extratos de cebola branca e roxa foram obtidos por extração em fase sólida utilizando coluna de poliamida e seus compostos identificados e quantificados pelas técnicas de Cromatografia líquida- ionização por elétron spray-espectrometria de massas e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodo. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelas curvas de multiplicação de cada micro-organismo. O efeito dos compostos quercetina aglicona (inibidor do QS já relatado na literatura e encontrado no extrato de cebola roxa) e quercetina-3-ß-D-glicosideo (um dos compostos majoritários encontrados em ambos extratos) sobre os micro-organismos utilizados neste estudo foi também avaliado. Foram obtidos três extratos: cebola branca em metanol (CB-MeOH), cebola branca em metanol amônia (CBMeOH/ NH4) e cebola roxa em metanol (CR-MeOH). Os compostos quercetina 3,4'- diglicosídeio, quercetina-4-glicosídeo, quercetina-3-ß-D-glicosideo e quercetina aglicona foram os predominantes nos extratos das duas variedades de cebola. Cianidina-3-O-glicosideo também foi identificada no extrato de cebola roxa. A concentração inibitória mínima (MIC) dos extratos foi igual ou superior a 125 µg/ml (p/v) de extrato seco. Não foi observada inibição significativa da produção de violaceína em C. violaceum pelos extratos orgânicos de cebola e nem pela quercetina-3-ß-D-glicosideo, nas concentrações sub-inibitórias avaliadas. No entanto, a quercetina aglicona inibiu significativamente a produção de violaceína em todas as concentrações. A glicosilação da quercetina pode ter afetado sua atividade sobre a inibição da produção de violaceina, já que estudos mostram menor atividade biológica deste composto quando glicosilado. Para a motilidade tipo swarming em P. aeruginosa PAO1 houve inibição significativa pelo extrato de cebola roxa, em todas as concentrações estudadas. Os demais extratos não apresentaram inibição contra este micro-organismo. Para S. marcescens MG1, foi observada inibição da motilidade swarming somente na concentração de 125 µg/ml de CBMeOH/ NH4. As análises de comparação entre os dois tipos de quercetina revelaram que, embora para as duas bactérias testadas os dois compostos apresentaram atividade inibitória sobre a motilidade tipo swarming, a quercetina-3-ß-D-glicosideo foi menos eficiente que a quercetina aglicona na concentração de 125 µg/ml. A formação de biofilmes não foi influenciada pelos extratos e, inesperadamente, não se detectou inibição da formação de biofilmes por ambos tipos de quercetina avaliados. De forma geral, os extratos orgânicos de cebola mostraram pouco efeito sobre os fenótipos controlados pelo quorum sensing e a glicosilação da quercetina provavelmente explica a baixa atividade antimicrobiana e anti-QS dos extratos

Many bacterial genes are regulated by a communication mechanism called quorum sensing (QS). In this system, signaling molecules activate a group behavior according to cell density, allowing the control of gene expression. Studies suggest the inhibitory potential of compounds extracted from plants on the QS system, like quercetin, a flavonol present in high concentrations in some fruits and vegetables. This compound is the main flavonoid found in onion (Allium cepa); however, there are no studies showing the anti-QS activity of organic extracts of this plant. The objective of this work was to evaluate the antimicrobial and anti-QS potential of organic extracts of white and red onions, and their major components studied in QS-regulated phenotypes such as violacein production in Chromobacterium violaceum, swarming motility and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 and Serratia marcescens MG1.White and red onion extracts were obtained by solid phase extraction using a polyamide column and its compounds were identified and quantified by Liquid Chromatography - Electron Spray-Mass Spectrometry and high performance liquid chromatography coupled to diode array detector. O The antimicrobial activity was evaluated by growth curves of each microorganism. The effect of non-glycosylated quercetin (a QS inhibitor already reported in the literature and found in red onion extract) and quercetin-3-ß-D-glycoside (one of the major compounds found in both extracts) on the microorganisms used in this study was also evaluated. Three extracts were obtained: white onion in methanol (CB-MeOH), white onion in methanol ammonia (CB-MeOH / NH4) and red onion in methanol (CR-MeOH). Our results showed that quercetin 3,4'- diglycoside, quercetin-4-glycoside, quercetin-3-ß-D-glycoside and non-glycosylated quercetin were predominant in the extracts of the two onion varieties. Cyanidin-3-O-glycoside has also been identified in the purple onion extract. The minimum inhibitory concentration (MIC) of extracts was equal or greater than 125 µg / ml (w / v) of dry extract. There was no significant inhibition of violacein production in C. violaceum by organic onion extracts or by quercetin-3-ß- D-glycoside at the sub-inhibitory concentrations evaluated. However, non-glycosylated quercetin showed a significant inhibition of violacein production in all tested concentrations. The glycosylation of Quercetin could have altered its inhibition activity towards violacein production, and in fact, some studies have shown less biological activity of some phenolic compounds when they have been glycosylated. For swarming motility in P. aeruginosa PAO1 there was significant inhibition by red onion extract, in all studied concentrations. The other extracts did not present inhibition against this microorganism. For S. marcescens MG1, inhibition of swarming motility was observed only at the concentration of 125 µg / ml of CB-MeOH / NH4. Comparative analyses between the two types of quercetin showed that, although for the two bacteria tested the two compounds showed inhibitory activity on swarming motility, quercetin-3-ß-D-glycoside was less efficient than non-glycosylated quercetin in the concentration of 125 µg / ml. Biofilm formation was not influenced by the extracts and unexpectedly, both types of quercetin evaluated did not show inhibition towards biofilm formation. In general, organic onion extracts showed little effect on quorum sensing controlled phenotypes and glycosylation of quercetin probably explains the low antimicrobial and anti-QS activity of the extracts

Influência de moléculas autoindutoras produzidas por Escherichia coli na formação de biofilme por Listeria monocytogenes / Influence of autoinducers produced by Escherichia coli on biofilm formation by Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes é um micro-organismo Gram-positivo que está comumente associado a doenças de origem alimentar. Possui a capacidade de sobreviver a condições adversas e de formar biofilme em diferentes superfícies abióticas, tornando-se um problema constante para a indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização e aumentar o risco de contaminação pós-processamento. A formação de biofilme pode ser regulada por um mecanismo denominado quorum sensing, no qual ocorre intensa comunicação célula-célula, mediada por moléculas químicas, chamadas de autoindutoras. Pouco se sabe sobre a ocorrência de interação entre bactérias Gram- positivas e negativas na formação de biofilmes, sendo mais frequentes estudos entre bactérias do mesmo grupo. A fim de avaliar a ocorrência de interação entre Escherichia coli e L. monocytogenes (Lm), desenvolveu-se esta pesquisa com os seguintes objetivos: i) verificar a capacidade de Lm sorotipo 1/2a selvagem e sua mutante isogênica (ΔprfA ΔsigB) formar biofilme em presença de Escherichia coli, avaliando-se a importância dos reguladores de virulência, prfA e sigB, no processo; e ii) verificar a produção e interferência de moléculas autoindutoras de E. coli E2348/69 na formação de biofilme por Lm. Os ensaios de formação de biofilme foram realizados utilizando-se lâminas de aço-inoxidável AISI 304 #4 imersas em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) e em meio pré-condicionado (MPC) por E. coli, com incubação a 25 ºC. Foram testadas duas concentrações iniciais de Lm (102 e 106 UFC.mL-1) e amostragens em diferentes tempos de incubação. Utilizou-se um método de quantificação indireto com coloração do biofilme por cristal violeta e posterior leitura da absorbância. Observou-se que Lm 1/2a selvagem e sua mutante isogênica (ΔprfA ΔsigB) são capaz de formar biofilme na presença de Escherichia coli e que uma maior quantidade de biofilme foi formada por Lm selvagem quando comparada à sua mutante, em meio não pré-condicionado (controle), indicando que prfA e sigB estão envolvidos no processo de formação de biofilme. Quando em MPC, o biofilme formado pela cepa selvagem foi menor que no meio controle (BHI), indicando que E. coli E2348/69, utilizada no pré-condicionamento do meio, produz moléculas capazes de interferir no processo de formação e na quantidade de biofilme formado por Lm; e para o biofilme formado pela cepa mutante, houve uma maior quantificação em MPC em comparação ao meio controle, o que sugere que os genes deletados possam estar envolvidos no reconhecimento das moléculas autoindutoras. Assim, os dados obtidos permitem concluir que há interação e interferência por parte de E. coli na formação de biofilme por Lm mediante produção de moléculas autoindutoras

Listeria monocytogenes (Lm) is a Gram-positive microorganism commonly associated with foodborne diseases. Due to its ability to survive under adverse environmental conditions and to form biofilm in different abiotic surfaces, this bacterium is a concern for the food industry, since it can compromise sanitation procedures and increase the risk of post-processing contamination. Biofilm formation can be regulated by a quorum sensing mechanism, in which there is intense cell-cell communication mediated by chemical molecules, called autoinducers. Little is known about the occurrence of interaction between Gram-positive and Gram-negative bacteria on biofilm formation. Thus, in order to evaluate the occurrence of interaction between Escherichia coli and Lm, this study was developed including the following objectives: i) to evaluate the ability of Lm 1/2a and its isogenic mutant strain (ΔprfAΔsigB) to form biofilm on the presence of Escherichia coli, assessing the importance of virulence regulators, prfA and sigB, in this process; and ii) to verify the production and interference autoinducers of E. coli E2348/69 on biofilm formation by Lm. Biofilm formation assays were conducted using stainless steel AISI 304 #4 immersed into broth brain heart infusion (BHI) and into preconditioned medium (MPC) by E. coli, following incubation at 25 °C. Lm at two initial concentrations (102 and 106 CFU.mL-1) and under different incubation time was tested. An indirect method for quantification of cells was applied, using crystal violet to color the biofilm, followed by optical density measurement. It was observed that Lm 1/2a and its isogenic mutant (ΔprfA ΔsigB) are able to form biofilm in the presence of Escherichia coli and a larger amount of biofilm was formed by wild strain Lm compared to its mutant, in a non-preconditioned medium (control), indicating that prfA and sigB are involved in biofilm formation. For MPC, the biofilm formation by the wild strain was lower than in the control (BHI), indicating that E. coli E2348/69, used in the preconditioned medium, produces molecules that can affect the formation process and the amount of biofilm formed by Lm; and in the biofilm formed by the mutant strain, there was a higher quantification of MPC compared to the control, suggesting that the deleted genes may be involved in recognition the of autoinducers. These results suggest that there is an interaction and interference of E. coli on biofilm formation by Lm due the production of autoinducers