Molecular investigation of Neorickettsia risticii in trematodes and snails in a region with serological evidence of this agent in horses, state of Rio de Janeiro / Pesquisa molecular de Neorickettsia risticii em trematódeos e moluscos em região com evidência sorológica do agente em equinos, estado do Rio de Janeiro

In Brazil, some studies have indicated that Neorickettsia risticii circulates in horses, but it is unclear which are the possible intermediate vectors of this bacterium in the country. The aim of this study was to use molecular techniques in order to analyze the presence of N. risticii in snails and larval stages of trematodes in farms in a region with a history of seroreactive horses towards this bacterium, in Rio de Janeiro, Brazil. Convenience sampling was used in the studied region. The collected snails were exposed to incandescent light (60W) for 2-4 hours in order to investigate trematodes in larval forms. Deoxyribonucleic acid (DNA) was extracted from snail tissue and trematode. Real-time PCR (qPCR) technique was used to investigate the presence of a 16S rRNA gene fragment of N. risticii. Snail specimens (n=410) were collected from 11 horse-breeding farms, and the following species were identified: Melanoides tuberculata, Pomacea sp., Biomphalaria tenagophila, Physa acuta, Drepanotrema anatinum and Biomphalaria straminea. Only 3.17% (n=13/410) of the collected snails were infected by trematodes. The cercariae obtained from these snails were classified as Megalourous cercariae, Pleurolophocercus cercariae and Furcocercous cercariae. There was no amplification of the target DNA of N. risticii in the snail and trematode samples tested by qPCR. Based on these data, the transmission of N. risticii by trematodes using these snail species in this region does not appear to occur or occurs at very low rates. Thus, further studies are needed in order to clarify which species of invertebrate hosts are infected by this bacterium and potentially participate in the transmission chain of equine neorickettsiosis in the state of Rio de Janeiro, Brazil.(AU)

No Brasil, estudos apontam a circulação de Neorickettsia risticii em equinos, contudo não estão claros quais os possíveis vetores intermediários dessa bactéria no país. O objetivo do presente estudo foi analisar a presença de N. risticii, utilizando-se técnicas moleculares, em caramujos e estágios larvais de trematódeos em propriedades rurais de uma região com histórico de equinos sororreativos para essa bactéria, no Rio de Janeiro, Brasil. Uma amostragem por conveniência foi utilizada na região de estudo. Os caramujos coletados foram expostos à luz incandescente (60W) durante duas-quatro horas para a investigação de trematódeos nas formas larvais. A extração de ácido desoxirribonucleico (DNA) foi realizada em tecidos de caramujos e trematódeos. A técnica de PCR em tempo real (qPCR) foi utilizada para investigar a presença de um fragmento do gene 16S rRNA de N. risticii. Foram coletados 410 espécimes de caramujos de 11 propriedades com criações de equinos, sendo identificadas as seguintes espécies: Melanoides tuberculata, Pomacea sp., Biomphalaria tenagophila, Physa acuta, Drepanotrema anatinum e Biomphalaria straminea. Apenas 3,17% (n=13/410) dos caramujos identificados estavam infectados por trematódeos. As cercárias obtidas desses caramujos foram classificadas em Megalourous cercariae, Pleurolophocercus cercariae e Furcocercous cercariae. Não foi observada a amplificação do DNA-alvo de N. risticii, por meio da qPCR, em nenhuma das amostras de caramujos e trematódeos testadas. Com base nesses dados, a transmissão de N. risticii por trematódeos que utilizam as espécies de caramujos nessa região parece não ocorrer ou ocorre a taxas muito reduzidas. Portanto, novos estudos são necessários para elucidar quais espécies de hospedeiros invertebrados se infectam por essa bactéria e potencialmente participam da cadeia de transmissão da neorickettsiose equina no estado do Rio de Janeiro, Brasil.(AU)

Epidemiological survey of Neorickettsia risticii in equids from the State of Rio de Janeiro, Brazil / Levantamento epidemiológico de Neorickettsia risticii em equídeos do Estado do Rio de Janeiro

Equine neorickettsiosis (EN), also known as Potomac Horse Fever, is a non-contagious disease caused by the bacterium Neorickettsia risticii of the Anaplasmataceae family. The objectives of this study were to detect the presence of anti-N. risticii antibodies by the indirect immunofluorescence assay (IFA) and of its DNA by qPCR in equids at high and low altitude regions in the State of Rio de Janeiro, Brazil, and to identify factors associated with seropositive equids by multiple logistic regression analysis. The frequency of anti-N. risticii antibodies was 16.05% (n=113/704). The animal age and breeding region were the factors that influenced the seropositivity rate for N. risticii in the equids (p<0.05). Equids from the lowland region had higher seropositivity (p<0.05; OR=5.87) compared to those of the mountain region. The presence of snails on the farm was a factor associated with this result (p<0.05; OR=2.88). In the lowland region, age of the animal and site of breeding were protective factors for the detection of antibodies anti-N. risticii in equids, with lower frequency of seropositivity in younger animals (p<0.05; OR=0.06) and in animals raised in dry areas (p<0.05; OR=0.22). The presence of the target DNA of N. risticii by qPCR was not observed in any of the samples tested. The existence of seropositive equids for N. risticii demonstrates a possible circulation of this agent in the studied area, and that the age related characteristics and equids breeding region are important factors regarding seropositivity in the State of Rio de Janeiro.(AU)

A Neorickettisiose equina (NE), também conhecida como Febre do Cavalo de Potomac, é uma doença não contagiosa causada pela bactéria Neorickettsia risticii da família Anaplasmataceae. Os objetivos deste estudo foram detectar a presença de anticorpos anti-N. risticii através da reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e do DNA dessa bactéria através da qPCR em equídeos de regiões de alta e baixa altitude no Estado do Rio de Janeiro, Brasil; e identificar os fatores associados com a soropositividade dos equídeos através da análise de regressão logística múltipla. A frequência de anticorpos anti-N. risticii foi de 16,05% (n=113/704). Observou-se que a idade e a região de criação foram os fatores que influenciaram a taxa de soropositividade para N. risticii nos equídeos (p<0,05). Equídeos da região de baixada apresentaram maior soropositividade (p<0,05; OR=5,87) quando comparado aos criados em região de montanha. A presença de caramujos na propriedade foi um fator associado a este resultado (p<0,05; OR=2,88). Na região de baixada, animais mais jovens (p<0,05; OR=0,06), criados em áreas secas (p<0,05; OR=0,22) demonstraram serem fatores de proteção na detecção de anticorpos anti-N. risticii. Não foi observada a presença do DNA-alvo de N. risticii através da qPCR em nenhuma das amostras testadas. A existência de equídeos soropositivos para N. risticii demonstra a possível circulação desse agente na área estudada, e as características inerentes a idade e a região de criação dos equídeos são fatores importantes relacionados à soropositividade no estado do Rio de Janeiro.(AU)

Frequency of Equine Monocytic Ehrlichiosis (EME) in Brazil / Relato epidemiológico da Erlichiose monocítica equina (EME) no Brasil

From a cross-sectional observational study with convenience samples, 347 blood samples from horses were collected from different physiographic regions, as follows: Santa Catarina Plateau (Santa Catarina State - SC), Médio Paraíba do Sul (São Paulo State - SP and Rio de Janeiro State RJ), Mountainous and Metropolitan regions (Rio de Janeiro State - RJ). Samples were tested for the presence of antibodies (IgG) anti Neorickettsia risticii by indirect immunofluorescence assay (IFA). The frequency obtained in this study corroborates with the ones obtained in the U.S.A., which refers to endemic regions. Fisher's exact test showed significant differences in the number of positive animals between regions, indicating that the probability of an animal becoming infected varies depending on the area. The CI 95% revealed no association between infection and geopolitical space. Moreover, Odds ratio test showed differences of an animal getting infected in different regions. This event could be influenced by the type of treatment used in each area, as the seasonal frequency of injury or even potential vectors. Therefore, there are seropositive animals for N. risticii in the studied areas, suggesting that this agent may be circulating in those regions. Future studies mainly based on molecular analyzes are needed to confirm these serological findings.

A partir de um delineamento observacional transversal com amostras de conveniência, 347 amostras de sangue foram coletadas de diferentes regiões fisiográficas: Planalto de Santa Catarina (Estado de Santa Catarina - SC), Região do Médio Paraíba do Sul (Estados de São Paulo - SP e Rio de Janeiro - RJ), Região Serrana e Metropolitana (ambas do Estado do Rio de Janeiro - RJ). As amostras foram testadas para a presença de anticorpos (IgG) anti-Neorickettsia risticii por imunofluorescência indireta (IFI). A prevalência obtida no presente estudo corrobora com demais resultados obtidos nos Estados Unidos da América. O Teste Exato de Fisher demonstrou diferença significativa no número de animais positivos entre as regiões, indicando assim que a probabilidade de um animal se infectar varia dependendo da região. O intervalo de confiança (IC 95%) revelou não haver associação entre a infecção e o espaço geopolítico, este evento pode ser influenciado pelo tipo de tratamento em cada área, como sazonalidade do agravo ou frequência de potenciais vetores. Assim, a soropositividade ora encontrada sugere a circulação de N. risticii nas áreas estudadas. Estudos futuros baseados, principalmente, em análises moleculares serão importantes para a confirmação dos achados sorológicos no presente trabalho.

Molecular detection of Neorickettsia risticii in Brazilian free-tailed bats (Tadarida brasiliensis) from Buenos Aires, Argentina

Neorickettsia risticii is the causative agent of Potomac Horse Fever, a severe febrile disease affecting horses, transmitted by trematodes species with a complex life cycle. A total of 30 insectivorous bats (Brazilian free-tailed bat Tadarida brasiliensis) were analyzed by PCR for presence of genus Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia and Rickettsia. Three samples showed positive reactions for genus Anaplasma, Ehrlichia and Neorickettsia, and the sequences were 99.67% identical to Neorickettsia risticii. The role of bats in the life cycle of N. risticii has yet to be elucidated; however bats may be reservoirs for this bacterium. To our knowledge, this is the first evidence of N. risticii in Argentina.

Pesquisa de trematódeos digenéticos em Heleobia spp. (Mollusca: Hydrobiidae) em área de ocorrência da Ehrlichiose monocítica equina, no Rio Grande do Sul, Brasil / Research of trematodes digenetics from Heleobia spp. (Mollusca: Hydrobiidae) in area of occurrence of equine monocytic ehrlichiosis, in Rio Grande do Sul, Brazil

A ehrlichiose monocítica equina (EME) na região Sul do Rio Grande do Sul tem demonstrado ser importante nas criações de cavalos Crioulos. A enfermidade foi relatada e diagnosticada como causa de diarreia, prejuízos com tratamentos e com a morte de equinos não estabulados, sendo apontada como um fator limitante na criação de equinos em algumas regiões. O modo de transmissão pela via oral, intermediada por trematódeos em ambientes aquáticos, tem sido sustentado. Caracóis dulciaquícolas estão envolvidos como hospedeiros intermediários de trematódeos albergadores de Neorickettsia risticii. Um total de 16.846 caracóis Heleobia foi coletado nos municípios de Arroio Grande, Rio Grande, Palmares do Sul e Santa Vitória do Palmar, 92,2% dos quais foram encontrados nas raízes de aguapés (Eichornea spp.). A frequência de trematódeos presentes nos caracóis variou de 2,3 a 12,8% nas propriedades coletadas. Foram encontrados três tipos de cercárias, morfotipo 1, morfotipo 2 e morfotipo 3, e dois morfotipos de metacercárias nos caracóis. Um total de 357 insetos da ordem Odonata foi coletado, fases de metacercárias foram encontradas no tegumento da subordem Anisoptera com frequência de 5,3%. Mais estudos são necessários para identificar as fases larvais encontradas, bem como para conhecer o hospedeiro definitivo, identificar o parasito adulto e a relação de seu ciclo de vida com a ocorrência da ehrlichiose monocítica equina.

The equine monocytic ehrlichiosis in the region South of the Rio Grande do Sul has demonstrated to be important in the creations of Crioulo horses. It has been reported as cause of diarrhea in equine not surround and as cause of losses with treatments and death of the animals, being pointed as a limited factor in the range breeding in some regions. The way of transmission for the oral way, intermediated for trematodes in aquatic environments, has been supported. Freshwater snails are involved as intermediate hosts of trematodes and harbor of the Neorickettsia risticii. A total of 16,846 Heleobia snails had been collected in the cities of Arroio Grande, Rio Grande, Palmares do Sul and Santa Vitoria do Palmar, 92.2% of which had been found in the roots of aquatics plants (Eichornea spp.). The frequency of trematodes present in the snails varied of 2.3 to 12.8% in the collected regions. Three types of cercariae were found, morphology type 1, morphology type 2 and morphology type 3, and two morphologic type of metacercariae of the snails. A total of 357 insects of the Odonata order were collected, stages of metacercariae had been found in the tissues of suborder Anisoptera with 5.3% of frequency. More studies are necessary for identification of the joined larval phases, as well as knowing the host definitive and identifying the adult parasite and the relation of its cycle of life with the occcurrence of equine monocytic ehrlichiosis.

Equine Monocytic Ehrlichiosis (EME) in Rio de Janeiro State, Brazil / Ehrliquiose Monocítica Eqüina (EME) no estado do Rio de Janeiro, Brasil

Realizaram-se testes de imunofluorescência indireta (IFI) para Ehrliquiose Monocítica Eqüina (EME) em soros de 27 eqüinos, provenientes de duas propriedades do estado do Rio de Janeiro (regiões Metropolitana e Serrana) onde ocorreram manifestações clínicas sugestivas de EME. Coletaram-se duas amostras de sangue de cada animal. Os intervalos entre as coletas variaram entre 30 e 180 dias. Vinte e um animais (77,8 por cento) foram reagentes à IFI com título 1:50, nos testes realizados nas duas amostras coletadas. Os demais (22,2 por cento) - animais 1 a 6 - foram reagentes à IFI, com títulos sorológicos de 1:100, 1:200, 1:400, 1:400, 1:400 e 1:800 na primeira coleta e 1:200, 1:800, 1:200, 1:400, 1:800 e 1:800 na segunda coleta, respectivamente. Três animais (1, 4 e 5) apresentaram manifestações subclínicas. Um animal (2) recuperou-se após o tratamento. Dois animais (3 e 6) evoluíram para óbito. Títulos sorológicos maiores que 1:320 são conclusivos para o diagnóstico específico. Este é o primeiro relato de EME no estado do Rio de Janeiro, Brasil