Aislamiento y caracterización celular de exosomas de plasma para su uso como biomarcadores de diagnóstico / Isolation and cellular characterization of exosomes from plasma for their use as diagnostic biomarkers / Purificação e caracterização celular de exossomos para seu uso como biomarcadores de diagnóstico

Los exosomas son vesículas membranosas extracelulares esenciales en la comunicación intercelular a larga distancia, viajan en los fluidos corporales y entregan mensajes moleculares dirigidos a la mayoría de las células de todo el organismo. La liberación de mensajes vía exosomas ocurre en forma de ADN, ARN o proteínas; dicha liberación se ha asociado a diferentes condiciones fisiológicas normales y patológicas, como el cáncer. Por lo anterior, el aislamiento eficiente y caracterización celular de exosomas de plasma es clave para su uso como biomarcadores no invasivos de diversas enfermedades. En el presente estudio se purificaron exosomas a partir de muestras clínicas de plasmas de pacientes previamente diagnosticados con retinoblastoma y de individuos sanos como control. Los exosomas recuperados fueron caracterizados a nivel celular por microscopia electrónica de transmisión empleando una técnica de criogenia. Para demostrar la correcta purificación de exosomas se confirmó la presencia de las proteínas transmembranales CD63 y CD81 mediante immunoblot. Adicionalmente de los exosomas purificados, se identificaron ARNs pequeños no codificantes llamados microARNs. En general, se describe la purificación y caracterización celular de exosomas obtenidos de plasma humano para su potencial uso como biomarcadores.

Exosomes are small extracellular vesicles essential in intercellular communication; they act as vehicles of broad scope. They are travelling in body fluids and delivering molecular messages to cells in the organism. Messages released by exosomes like DNA, RNA and proteins are associated with different pathological conditions including cancer. Therefore, the efficient isolation and cellular characterization of exosomes from plasma is essential to use them as biomarkers in many diseases. Here, exosomes were purified from patients diagnosed with pediatric cancer and healthy individuals as control. The exosomes recovered were characterized using cryogenic transmission electron microscopy. Moreover, the presence of CD63 and CD81 transmembrane proteins was confirmed using Western blot. Besides, miRNAs presence was identified from exosomes. This work describes a complete technique to isolate and characterize exosomes from human plasma, recognizing their potential as biomarkers.

Os exossomos são vesículas membranosas extracelulares essenciais na comunicação intercelular de longa distância; eles viajam em fluidos corporais e entregam mensagens moleculares dirigidas à maioria das células de todo o organismo. A liberação de mensagens através dos exossomos ocorre em forma de DNA, RNA ou proteínas; essa liberação foi associada a diferentes condições fisiológicas normais e patológicas, tais como o câncer. Por tudo isso, o eficiente isolamento e caracterização celular de exossomos de plasma é chave para sua utilização como biomarcadores não invasivos de várias doenças. No presente estudo, exossomos foram purificados a partir de amostras clínicas de plasmas de pacientes que tinham sido diagnosticados previamente com retinoblastoma e de indivíduos saudáveis como controle. Os exossomos recuperados foram caracterizados a nível celular por microscopia eletrônica de transmissão usando uma técnica de criogenia. Para demonstrar a correta purificação dos exossomos, foi confirmada a presença de proteínas transmembranares CD63 e CD81 usando inmunoblot. Além dos exossomos purificados foram identificados ARNs não codificantes pequenos chamados microARNs. Em geral os métodos de purificação e caracterização celular de exossomos obtidos de plasma humano são descritos por seu potencial utilização como biomarcadores.

Actualización en el diagnóstico de la leptospirosis humana / Updating on the diagnosis of human leptospirosis

La leptospirosis humana es una enfermedad zoonótica de distribución mundial, con frecuencia subdiagnosticada por presentar un amplio espectro de manifestaciones clínicas. El objetivo es presentar una actualización sobre el diagnóstico de la leptospirosis humana. Se consultó la bibliografía disponible sobre el tema en las bases de datos de Scielo, HINARI, Pubmed-Medline y diferentes textos y artículos en los que se profundizaba en el diagnóstico. Las técnicas microbiológicas son la base de la confirmación de la enfermedad. La observación por microscopía de campo oscuro es poco sensible, ya que las leptospiras se pueden confundir con filamentos proteicos u otros artefactos. El aislamiento del agente etiológico constituye la prueba de oro, aunque ofrece un resultado retrospectivo. La reacción en cadena de la polimerasa es un método útil para el diagnóstico rápido de la infección. El diagnóstico serológico cobra vital importancia en esta entidad, pues supera en rapidez, sencillez y bajo costo al cultivo. La microaglutinación con antígenos vivos es la técnica de referencia. Las pruebas rápidas basadas en la inmunocromatografía de flujo lateral son una variante muy útil, ya que ofrecen el resultado entre 5 y 30 minutos.

The human leptospirosis is zoonotic disease with worldwide distribution, frequently present a difficult diagnosis because have a wide spectrum of clinical manifestations. The objective of this work is to present an upgrade on the diagnosis of the human leptospirosis; for it was consulted it the available bibliography on the topic in the databases of Scielo, HINARI, Pubmed-Medline and different texts and articles of the last five years to deepen in the diagnosis. The microbiologic diagnostic is the base of the confirmation of the illness; it depends on the taking of sample in the appropriate moment and the correct indication of the complementary one according to the clinical phase. The observation for microscopy of dark field is not very sensitive since the leptospiras can made a mistake with poetics filaments or other devices. The etiologic agent's isolation constitutes the gold standard test; although offers a retrospective result. The polymerase chain reaction is a method used for the quick diagnosis of the infection, the quantitative variant in real time shows substantial advantages, because it allows the immediate reading and avoids the electrophoresis step, these techniques are not available for its high cost. The serologic diagnostic charges vital importance in this entity, it overcomes in speed, simplicity and low cost to the cultivation; the microagglutinación with a live antigen is considered the reference technique. The detection of IgM for enzyme linked immunobsorbent assay has been broadly used. The rapid tests based on the lateral flow immunochromatography, are a very useful variant, since they offer the result between 5 and 30 minutes.

Primera experiencia en aislamiento de celulas endoteliales humans en Bolivia / First experience in the isolation of human endothelian cells in Bolivia

INTRODUCCIÓN: las células endoteliales pueden proveer información valiosa con respecto a muchos procesos patológicos como la aterosclerosis, inflamación, neoplasia y angiogénesis. Este trabajo describe la primera experiencia boliviana en el aislamiento y cultivo de células endoteliales humanas derivadas de la vena umbilical (HUVEC). MÉTODOS: Un segmento largo de cordón umbilical se utilizó para el aislamiento y fue tratado por digestión con colagenasa. Las células endoteliales fueron desprendidas de la íntima y posteriormente cultivadas en medio de cultivo M199 y suero fetal bovino. Técnicas morfológicas, inmunohistoquímicas y de citometría de flujo fueron utilizadas para identificar estas células. RESULTADOS: Se examinaron las células endoteliales obtenidas por análisis morfológico e inmunohistoquímico. El marcaje con CD34 fue positivo para más del 90% de las células obtenidas por digestión con colagenasa analizado por citometría de flujo. CONCLUSIÓN Se logró aislar y cultivar HUVEC de manera exitosa. Una gran variedad de experimentos y aplicaciones en ciencias biomédicas pueden ser potencialmente factibles.

INTRODUCTION: endothelial cell study yields valuable information concerning many pathologic processes such as atherosclerosis, inflammation, neoplasia and angiogenesis. This paper describes the first Bolivian experience in isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). METHODS: a long segment of the umbilical cord was processed by collagenase digestion. Endothelial cells were detached from intima and further cultured using M199 culture media. Morphologic, immunochemistry and flow cytometry approaches were used to identify these cells. RESULTS: morphologic and immunochemistry analysis of the pool of obtained cells were positive for HUVEC. CD34 staining was positive in more than 90% of the cells obtained by collagenase digestion as assessed by flow cytometry. CONCLUSION: HUVEC were successfully isolated for the first time in Bolivia. A great deal of further experiments and applications in biomedical sciences is possible