Sporothrix brasiliensis: aspectos imunológicos e virulência / Sporothrix brasiliensis: immunological aspects and virulence

A esporotricose caracteriza-se como uma micose subcutânea causada por fungos dimórficos do gênero Sporothrix, capazes de acometer o homem e uma grande variedade de animais, dentre eles os felinos. A princípio, Sporothrix schenckii era a única espécie conhecida como responsável pela esporotricose. Após estudos genotípicos e fenotípicos de isolados ambientais, clínicos humanos e animais, verificou-se alta variabilidade entre os isolados e estabeleceu-se a existência de um Complexo Sporothrix. Dentro deste, a maior causadora de surtos epidêmicos, justificada por uma maior virulência e capacidade de evasão da resposta imune, é a espécie Sporothrix brasiliensis. Nesse sentido, dada a ausência de estudos direcionados a está espécie, objetivou-se avaliar a importância de receptores Toll like-2 (TLR-2) e Toll like-4 (TLR-4) na infecção por S. brasiliensis. Além disso, utilizando técnicas de proteômica, procurou-se elucidar proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis quando comparado à espécie S. schenckii. Para avaliação da resposta imune utilizaram-se modelos in vitro e in vivo de infecção, e para a investigação das proteínas diferencialmente expressas, utilizou-se a técnica de proteômica Bottom-up. A investigação da resposta imune in vitro mostrou a dependência dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desencadeamento da resposta imune. Os ensaios in vivo mostraram a importância desses receptores no controle da infecção e dependência dos mesmos na produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de infecção. Na ausência do receptor TLR-2, houve a polarização de resposta Th17 na tentativa de controle da infecção. Quando avaliadas as diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S. schenckii, em termos de proteínas expressas, verificou-se que S. brasiliensis expressa diferencialmente 60 proteínas. Dentre essas, 9 são relatadas na literatura, como importantes na virulência e escape imunológico dos principais fungos de importância médica. Os resultados encontrados no presente trabalho permitem concluir que reconhecimento de S. brasiliensis é dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estudos que investiguem a utilização de outras vias de sinalização como mecanismos compensatórios, bem como, o sinergismo desses receptores no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da fisiopatologia dessa doença. No que tange a caracterização proteica, estudos com mutantes para cada uma das proteínas descritas nesse trabalho devem ser avaliados

Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by dimorphic fungi of the genus Sporothrix that affects humans and animals, predominantelly felines. Inicially, Sporothrix schenckii was the only specie associated to sporotrichosis. However, after genotypic and phenotypic studies of human and animal clinical isolates, a high variability among the isolates was found and was concluded the existence of a complex: the Sporothrix Complex. Inside the Sporothrix complex, the major cause of epidemic outbreaks, justified by a greater virulence and ability to evade the immune system, is Sporothrix brasiliensis. Concerning this, the absence of studies directed to this specific specie, the aim was to evaluate the importance of Toll like receptor-2 (TLR-2) and Toll like receptor-4 (TLR-4) during S. brasiliensis infection. In addition, was look using proteomics techniques, the proteins differentially expressed in S. brasiliensis when compared to S. schenckii. To evaluate the immune response, in vitro and in vivo tecniques were used, and for the investigation of differentially expressed proteins, the Bottom-up proteomics technique was used. The investigation of the in vitro immune response showed the dependence of TLR-2 and TLR-4 receptors on phagocytosis and the production of inflammatory mediators, such as cytokines and NO. In vivo assays showed the importance of these receptors to control the infection and their dependence on cytokine production during the first 14 days of infection. In the absence of the TLR-2 receptor, the Th17 response was polarized in an attempt to control the infection. Evaluating the differences between S. brasiliensis and S. schenckii, in terms of expressed proteins, it was verified that S. brasiliensis differentially expressed 60 proteins. Among these, 9 are reported in the literature, as important in the virulence and immune evasion among the most important medical fungi. The results found in the present study allow to conclude that S. brasiliensis recognition is dependent on TLR-2 and TLR-4 receptors. Studies investigating the use of other signaling pathways as compensatory mechanisms, as well as the synergism of these receptors in the context of S. brasiliensis infection, are fundamental to understand the pathophysiology of this disease. Regarding the protein characterization, studies with mutants for each of the proteins described in this work should be evaluated

Diagnóstico serológico de la esporotricosis mediante el empleo del antígeno de micelio de Sporothrix schenckii sensu stricto / Serological diagnosis of sporotrichosis using an antigen of Sporothrix schenckii sensu stricto mycelium

En este estudio se desarrolló y se evaluó el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), para la detección de anticuerpos en sueros de pacientes con esporotricosis, para lo cual se empleó un antígeno crudo de Sporothrix schenckii sensu stricto obtenido a partir de la forma micelial. Los sueros positivos para esporotricosis fueron ensayados por otras técnicas serológicas: inmunodifusión doble (IDD) y contrainmunoelectroforesis (CIE). El ensayo fue validado utilizando sueros de otras patologías como histoplasmosis, paracoccidioidomicosis, tuberculosis, leishmaniasis, lupus y sueros de individuos sanos como controles negativos. Se encontró una especificidad de 100 % con las técnicas utilizadas y una sensibilidad del antígeno de S.schenckii sensu stricto, por encima del 98% para IDD, CIE y ELISA. Estos resultados demuestran la alta sensibilidad y especificidad del antígeno de S. schenckii sensu stricto, para el diagnóstico de la esporotricosis, empleando las técnicas de IDD, CIE y ELISA. Los resultados sugieren, que este antígeno podría ser usado en conjunto con otras pruebas convencionales para el diagnóstico diferencial y puede ser útil para monitorizar la evolución de la enfermedad y respuesta al tratamiento.

We developed and analyzed an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) in order to detect antibodies in sera from sporotrichosis patients. We used a crude antigen of Sporothrix schenckii sensu stricto, obtained from the mycelial phase of the fungi. Positive sera were analyzed by other serological techniques such as double immunodiffusion (IGG) and counterimmunoelectrophoresis (CIE). The assay was validated by using sera from patients with other pathologies such as: histoplasmosis, paracoccidioidomycosis, tuberculosis, leishmaniasis, lupus and healthy individuals as negative controls. For the Sporothrix schenckii sensu stricto antigen, we found a 100% of specificity by every technique and sensitivity higher than 98% with IDD, CIE and ELISA. Our results show a high sensitivity and specificity for the Sporothrix schenckii sensu stricto antigen, so it can be used for IDD, CIE and ELISA. The results suggest that this antigen could be used in conjunction with other conventional tests for differential diagnosis and may be useful for monitoring the disease progression and response to treatment.

2D-immunoblotting analysis of Sporothrix schenckii cell wall

We utilized two-dimensional gel electrophoresis and immunoblotting (2D-immunoblotting) with anti-Sporothrix schenckii antibodies to identify antigenic proteins in cell wall preparations obtained from the mycelial and yeast-like morphologies of the fungus. Results showed that a 70-kDa glycoprotein (Gp70) was the major antigen detected in the cell wall of both morphologies and that a 60-kDa glycoprotein was present only in yeast-like cells. In addition to the Gp70, the wall from filament cells showed four proteins with molecular weights of 48, 55, 66 and 67 kDa, some of which exhibited several isoforms. To our knowledge, this is the first 2D-immunoblotting analysis of the S. schenckii cell wall.

Caracterização da glicoproteína de 70 kDa de Sporothrix schenckii e sua participação na regulação da resposta imune na esporotricose experimental / Characterization of the glycoprotein of 70 kDa of Sporothrix schenkii and its participation in the immune response in experimental sporotrichosis

A esporotricose é uma micose subcutânea de caráter crônico e de ampla distribuição mundial, cujo agente patogênico é o fungo dimórfico térmico, Sporothrix schenckii. Esse trabalho teve como principal objetivo a caracterização da atividade biológica da glicoproteína de 70 kDa (gp70), secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, visando à produção de anticorpos monoclonais e estudos de imunização passiva. Para atingir tais objetivos, foi produzido um hibridoma secretor de anticorpos monoclonais contra a fração de 70 kDa, denominado de AcMo P6E7. Através de ensaios de imunização passiva, foi observado que a administração do AcMo P6E7 em camundongos BALB/c foi capaz de modificar o curso da infecção experimental por S. schenckii, protegendo esses animais contra a infecção. Através de ensaios de imunofluorescência foi verificado que a gp70 está presente na superfície das células leveduriformes de S. schenckii e é uma adesina putativa para fibronectina e laminina...

Sporothrix schenckii and sporotrichosis

Durante muito tempo a esporotricose foi descrita como uma doença de baixa incidência no Brasil, no entanto, relatos recentes mostram que não só o número de casos descritos vem aumentando como a incidência de formas clínicas mais graves ou atípicas da doença vem ocorrendo com maior frequência. Dados recentes apontam que este grupo clínico já constitui cerca de 10% dos casos de esporotricose com diagnóstico confirmado. Apresentações clínicas mais raras, principalmente a esporotricose osteoarticular, podem estar associadas tanto a quadros de imunodepressão do paciente quanto à transmissão zoonótica desta doença. O diagnóstico da forma extracutânea ou de formas atípicas é um desafio que tem como ferramenta auxiliar o desenvolvimento recente de um teste sorológico para o diagnóstico das diferentes formas clínicas da esporotricose.

Actividad inmunologica de antigenos miceliales y levaduriformes de diferentes fases de crecimiento de Sporothrix schenckii / Immunological activity of mycelial and yeast antigens from different growth phases of Sporothrix schenckii

Los antígenos metabólicos de Sporothrix schenckii tienen gran utilidad en el diagnóstico y pronóstico de la esporotricosis. La actividad inmunológica de estas moléculas antigénicas, puede variar dependiendo de la cepa utilizada, los medios de cultivo donde crece el hongo, la metodología empleada para su obtención y la morfología del hongo. En el presente trabajo se observa el efecto que tiene la fase de crecimiento de este microorganismo en la actividad inmunológica de antígenos metabólicos, obtenidos de sus formas micelial y levaduriforme. Estos fueron logrados con filtrados de cultivo en diferentes fases de crecimiento y se ensayaron en las pruebas de inmunodifusión (ID) y contrainmunoelectroforesis (CIE) con sueros de pacientes con esporotricosis. A todos se les determinó su contenido proteico y polisacárido. En ambas formas de crecimiento (micelial y levaduriforme) los resultados mostraron un aumento gradual en cuanto a la concentración de polisacáridos de los antígenos durante la fase logarítima de crecimiento, mientras que la concentración de proteínas permaneció constante. La actividad inmunológica mostró un aumento en el número de bandas en la ID y CIE en los antígenos derivados del inicio de la fase estacionaria. Se encontró reacción cruzada en la ID con un suero de paciente con histoplasmosis. Los mejores resultados en ID y CIE se obtuvieron con los antígenos derivados del final de la fase logarítmica de crecimiento