Isolation and genetic stability of an infectious bronchitis virus strain (IBV) / Isolamento e estabilidade genética de uma cepa do vírus da bronquite infecciosa (IBV)

O vírus da bronquite infecciosa (IBV) é um importante patógeno respiratório presente na avicultura comercial e tem provocado grandes perdas econômicas em todo o mundo. A vacinação é realizada pela indústria produtora de aves, mas continuam surgindo novos sorotipos e variações antigênicas, dificultando o controle de IBV. Nós realizamos uma caracterização molecular de uma cepa de IBV obtida diretamente de tecidos e comparamos com a mesma cepa que havia sido passada três vezes em ovo embrionado. Nós mostramos uma variação significante na sequência viral depois de ter sido isolada em ovo embrionado.(AU)

Increased expression of interleukin-6 related to nephritis in chickens challenged with an avian infectious bronchitis virus variant / Aumento da expressão de interleucina-6 relacionada com nefrite in galinhas desafiadas com uma variante do vírus da bronquite infecciosa

A Brazilian field isolate (IBV/Brazil/PR05) of avian infectious bronchitis virus (IBV), associated with development of nephritis in chickens, was previously genotyped as IBV variant after S1 gene sequencing. The aim of this study was to evaluate the levels of IL-6 in kidneys and trachea of birds vaccinated and challenged with IBV/Brazil/PR05 strain, correlating these results with scores of microscopic lesions, specific IBV antigen detection and viral load. The up-regulation of IL-6 and the increased levels of viral load on renal and tracheal samples were significantly correlated with scores of microscopic lesions. Reduced levels of viral load were detected in kidneys of birds previously vaccinated and challenged, compared to non-vaccinated challenged group, although markedly microscopic lesions were observed for both groups. The expression of IL-6, present both in the kidney and in the tracheas, was dependent on the load of the virus present in the tissue, and the development of lesions was related with IL-6 present in the tissues. These data suggest that variant IBV/Brazil/PR05 can induce the expression of proinflammatory cytokines in a manner correlated with viral load and increased IL-6 is involved in the tissue with the influx of inflammatory cells and subsequent nephritis. This may contribute with a model to the development of immunosuppressive agents of IL-6 to prevent acute inflammatory processes against infection with IBV and perhaps other coronaviruses, as well as contribute to the understanding of the immunopathogenesis of IBV nephropatogenic strains.

Uma estirpe variante do vírus da bronquite infecciosa (VBI) associada com o desenvolvimento de nefrite em galinhas, foi isolado e identificado como variante por análise do gene S1. A estirpe IBV/Brazil/PR05 foi testada quanto à sua capacidade de induzir a expressão de interleucina-6 (IL-6) nos tecidos renais e traqueais. Galinhas vacinadas com a estirpe Massachusetts H120 e não vacinadas foram desafiadas com a estirpe IBV/Brazil/PR05. Cinco dias após a infecção, traquéias e rins foram coletados para análise por RT-qPCR, imunohistoquímica e histopatologia. Foi determinada a expressão relativa de IL-6 e da carga viral. A expressão de IL-6 e carga viral foram correlacionadas com o desenvolvimento de nefrite e lesão traqueal. A expressão de IL-6 foi maior quando houve aumento da carga viral na traqueia e nos rins. A carga viral presente nos rins foi inferior quando as aves foram vacinadas, entretanto foi observada nefrite acentuada. Houve alta correlação entre o desenvolvimento de nefrite e o nível de expressão de IL-6, bem como a expressão de IL-6 e a carga viral. A expressão de IL-6, presente tanto nos rins e nas traqueias, foi relacionada a carga viral presente nestes tecidos, e o desenvolvimento das lesões foi relacionado com a expressão de IL-6. Estes dados sugerem que a variante IBV/Brazil/PR05 pode induzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias de forma correlacionada com a carga viral, e o aumento de IL-6 está envolvido com o influxo de células inflamatórias no tecido, o que evolui para o desenvolvimento de nefrite. Isto pode contribuir como um modelo para o desenvolvimento de agentes imunossupressores da IL-6 para evitar processos inflamatórios agudos contra infecção com o VBI e talvez outros coronavírus, bem como contribuir para o entendimento da imunopatogênese das estirpes nefropatogênicas deste vírus.

Molecular analysis of the nucleocapsid gene and 3[1] untranslated region of two infectious Bronchitis Virus field isolates from Iranian poultry farms

Infectious bronchitis [IB] is an economically important disease of chickens. Due to the emergence of new variants of infectious bronchitis virus [IBV], the control of IB has become a serious problem for the poultry industry worldwide. In the present study, the nucleocapsid gene [N] and 3' untranslated region [UTR] of two IBVs isolated from Iranian poultry farms were sequenced and compared with other IBV strains. Based on nucleotide identity, the N gene and 3' UTR sequences of Iranian IBVs showed 90% similarity to the commonly used IBV vaccine strains, H52 and HI20. However, based on phylogenetic analyses, Iranian IBVs were found to cluster separately from the IBV vaccine strains used in Iran as well as other IBVs isolated in China, Australia and the United States. It was concluded that IBVs circulating in Iran are genetically distinct from IBV vaccine strains that have been used in Iran for many years. Therefore, it is important to develop a new vaccine based on these newly identified strains for controlling IB in Iranian poultry farms

Assessment of Newcastle and infectious bronchitis pathogens, and Salmonella spp. in wild birds captured near poultry facilities / Pesquisa de Salmonella spp., de doença de Newcastle e de bronquite infecciosa em aves silvestres capturadas próximo a instalações avícolas

Aves de vida livre podem ser carreadoras e disseminadoras de agentes patogênicos e representarem um risco para galinhas de produção. O objetivo deste trabalho foi verificar em aves de vida livre a presença de anticorpo contra: Salmonella Pullorum (SP), vírus da doença de Newcastle (VDN) e vírus da bronquite infecciosa (VBI), bem como a presença de Salmonella spp. De 48 aves de vida livre capturadas nas imediações de uma granja avícola, no norte do Estado de São Paulo, em 2005 e 2006, foram colhidos soros para realização de testes de soroaglutinação rápida em placa (SAR) para SP, inibição de hemaglutinação (HI) para o VDN e soroneutralização (SN) para VBI. Foram colhidos fragmentos de fígado, baço e ovários/testículos, todos cultivados juntos como um pool e conteúdo intestinal separado, para cultura de Salmonella spp. Todas as amostras foram negativas para a doença de Newcastle e bronquite infecciosa. Quanto à Salmonella Pullorum, pela técnica de SAR, a amostra de Theristicus caudatus foi positiva. No exame bacteriológico, foi isolado o agente em três aves: Theristicus caudatus (Salmonella Muenchen), Zenaida auriculata (Salmonella Enteritidis) e em Cariama cristata tanto Salmonella Muenchen como Salmonella Saintpaul.

Genetic grouping of avian infectious bronchitis virus isolated in Brazil based on RT-PCR/RFLP analysis of the S1 gene / Agrupamento genético de isolados do vírus da bronquite infecciosa das aves no Brasil com base na análise do gene S1 por RT-PCR-RFLP

Twelve Brazilian isolates and one reference vaccine strain of avian infectious bronchitis virus (IBV) were propagated in embryonating chicken eggs. The entire S1 glycoprotein gene of these viruses was analysed by reverse-transcriptase-polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (RT-PCR-RFLP), using the restriction enzymes HaeIII, XcmI and BstyI. The RFLP patterns led to the classification of these isolates into five distinct genotypes: A, B, C, D and Massachusetts. Five of twelve isolates were grouped in Massachusetts genotype and the remaining seven viruses were classified into four distinct genotypes: A (2), B (2), C (2) or D (1). Such genotyping classification agreed with previous immunological analysis for most of these viruses, highlighting the occurrence of a relevant variability among the IBV strains that are circulating in Brazilian commercial poultry flocks.

Doze isolados de campo do Brasil e uma estirpe de referência vacinal do vírus da bronquite infecciosa das aves (VBI) foram propagadas em ovos embrionados SPF. O gene S1 dessas amostras foi analisado por RT-PCR seguido de RFLP, empregando-se as enzimas de restrição HaeIII, XcmI e BstyI. Observou-se a existência de cinco genotipos diferentes: M (Massachusetts), A , B, C e D. Cinco dos doze isolados de campo do VBI foram classificados no genótipo Massachusetts e os sete vírus restantes foram classificados em quatro genotipos diferentes; A (2), B (2), C (2) ou D (1). Os resultados desta genotipagem concordam com os dados obtidos na análise imunológica previamente realizada para a maior parte destes vírus, destacando a ocorrência de uma variabilidade marcante entre os isolados do VBI que estão circulando nas granjas avícolas comerciais do Brasil.

Antibodies specific to infectious bronchitis in broilers in Ceará state, Brazil

The experiment was carried out to determine the antibody levels to infectious bronchitis virus (IBV) in 1120 broilers of two broiler flocks, both from the same parental flock and free from previous vaccination. Forty chicks of each line were alloted to the control group and the sera were tested by indirect ELISA. The vaccination program consisted on the administration of commercial vaccines against IBV at 10 and 25 days of age. Chicks with low levels of maternal antibodies (Mab) did not show significant titers to the first vaccinal stimulus. They presented a vaccinal response to the second vaccinal stimulus reaching the top around GMT 1100 at 45 days. Chicks with high Mab titers did not show significant titers to the primary and secondary vaccinal stimuli, reaching peak levels of GMT 500 at 45 days. No antibody response was detected after the primary vaccination at day 10. A delayed antibody response was detected after the secondary vaccination on day 25, indicating no previous priming. The maternal antibody titers can interfere on the response to the first and second vaccinal stimulus promoting the neutralization of the first vaccination and a different response to the second one, according to high or low maternal antibodies.

Utilizaram-se 1120 pintos de um dia de idade, de duas linhagens, não vacinados, para determinar os níveis de anticorpos para o vírus da bronquite infecciosa (VBI) em frangos de corte no estado do Ceará. Quarenta aves de cada linhagem, colocadas em boxes isolados e não vacinadas, foram usadas como controle. As aves vacinadas contra VBI aos 15 e 25 dias foram submetidas a coletas de sangue periódicas para avaliação, pelo ELISA indireto, dos títulos de anticorpos para VBI. As aves com baixos títulos de anticorpos maternos (AcM) não apresentaram títulos significativos ao primeiro estímulo vacinal; para o segundo estímulo, o pico de resposta de GMT 1100 ocorreu aos 45 dias. As com elevado título de AcM não responderam significativamente à primeira vacinação e o pico de resposta ao segundo estímulo de GMT 500 ocorreu aos 45 dias. Não se verificou resposta de anticorpos para o primeiro estímulo vacinal, observando-se resposta tardia somente para o segundo. Os AcM podem ter interferido tanto no primeiro quanto no segundo estímulo, promovendo neutralização da primeira vacinação e resposta diferenciada para a segunda de acordo com o nível, elevado ou baixo, de AcM.

Isolation and molecular characterization of infectious bronchitis virus, isolate Shiraz 3. IBV, by RT-PCR and restriction enzyme analysis

Infectious bronchitis virus [IBV] strain 4/91, prototype of the 793/B serogroup, was recently reported from Khouzestan province, Iran. Here we isolated and molecularly characterized a virus [Shiraz3. IBV] from broilers in Fars province. Following virus propagation in embryonated chicken eggs, we extracted total RNA containing the viral RNA from allantoic fluid. cDNA of the entire SI and nucleocapsid [N] genes were generated with AMV-reverse transcriptase and genomic specific primers. The cDNA was subsequently amplified in a polymerase chain reaction [PCR]. Digestion of the PCR products representing the entire SI gene generated restriction fragments identical to those expected from strain 4/91 and differed from the control vaccine strain of H120. The N RT-PCR products representing the entire N genes of strains Shiraz3. IBV and H120 did not show any visible difference in size. The results presented here demonstrated that isolate Shiraz3. IBV is genetically closely related to strain 4/91 of IBV and can be differentiated from the IBV vaccine strain in Iran

Caracterización antigénica de un virus de la bronquitis infecciosa, aislado en pollos de traspatio en Yucatán, México / Antigenic characterization of an infectious bronchitis virus isolated in backyard chicken in the state of Yucatan, Mexico

La producción animal de traspatio es una actividad tradicional en México, cuya finalidad es solucionar algunos problemas de la difícil situación económica de los campesinos. Los pollo son la especie más común en dicho sistema en Yucatán y son alimentados con subproductos, En estudios previos se encontró que las enfermedades respiratorias constituyen las más importantes en estos animales. En el presente estudio se obtuvo un aislamiento del virus de la bronquitis infecciosa en pollos de engorda introducidos al traspatio del poblado Sinanché, Yucatán, México; aquél se denominó SIN6. La caracterización antigénica de este aislamiento se realizó mediante la prueba de inhibición de la hemaglutinación, utilizando antígeno hemaglutinante producido a partir de 11 serotipos de referencia del virus de la bronquitis infecciosa (Massachusetts 41, Arkansas, Connecticut, Holte, CVL/9, 793/B, Holandés 274, Holandés 1466, Australiano "T", italiano 624, y Chileno 368), y antisueros contra estos serotipos y el Iowa 97; de este último no se logró obtener antígeno a pesar de repetidos intentos. El aislamiento SIN6 tuvo una relación antigénica baja con todos los serotipos de referencia, lo que indica que probablemente es un serotipo nuevo, aunque estudios de secuencia genética son necesarios para confirmarlo. El serotipo CVL/9 presentó una fuerte relación antigénica con todos los demás, esta circunstancia lo hace un candidato para la producción de una vacuna universal contra la bronquitis infecciosa

Studies on cell cultures as a method used for adaptation of infectious bronchitis virus

The infectious bronchitis virus [IBV] was passaged ten successive times in both of chicken embryo fibroblast [CEF] as primary cell culture origenated from a specific host and baby hamester kidney [BHK] and African green monkey kidney [VERO] cell cultures as cell lines origenated from non-specific mammelian hosts aiming to obtain a cell culture-adapte IBV to be used in the different serological experiments instead of embryonated chicken eggs which usually associated with some problems in addition to the long time consumed and the relatively higher economic costs. It was found that the cytopathic effect [CPE] of the virus began to appear on the 7[th], 6[th] and 5[th] day post infection of CEF, BHK and VERO cells respectively while the harvestation time was on the 10[th] day post infection in the 3 cell cultures. The periods on which the CPE and harvestatin were detected, began to decrease by the successive virus passages to become fixed 2 and 3 days post cell infection respectively after the 8[th]. passage in CEF, 16[th]. passage in BHK and 5[th] passage in VERO. The obtained virus titre, after 10 passages, was 10[6], 10[7] and 10[8] TCID[50] /0.1 ml in CEF, BHK and VERO cells respectively. The growth curve of IBV in the used cell cultures, revealed that the optimum time for virus harvestation is 72 hours post cell infection. It was concluded that the IBV could be successfully adapted to cell culture to be used in different serological tests to avoid the use of embryonated chicken eggs