RESUMO
This work aimed to assess pathogenic potential and clonal relatedness of Aeromonas sp. and Vibrio cholerae isolates recovered during a diarrhea outbreak in Brazil. Clinical and environmental isolates were investigated for the presence of known pathogenic genes and clonal relatedness was assessed by intergenic spacer region (ISR) 16S-23S amplification. Four Aeromonas genes (lip, exu, gcat, flaA/B) were found at high overall frequency in both clinical and environmental isolates although the lip gene was specifically absent from selected species. A fifth gene, aerA, was rarely found in A. caviae, the most abundant species. The ISR profile revealed high heterogeneity among the Aeromonas isolates and no correlation with species identification. In contrast, in all the V. cholerae isolates the four genes investigated (ctxA, tcpA, zot and ace) were amplified and revealed homogeneous ISR and RAPD profiles. Although Aeromonas isolates were the major enteric pathogen recovered, their ISR profiles are not compatible with a unique cause for the diarrhea events, while the clonal relationship clearly implicates V. cholerae in those cases from which it was isolated. These results reinforce the need for a better definition of the role of aeromonads in diarrhea and whether they benefit from co-infection with V. cholerae.
O objetivo deste trabalho foi estabelecer o potencial patogênico e a relação clonal de isolados de Aeromonas sp. e Vibrio cholerae obtidos durante um surto de diarréia. Isolados clínicos e ambientais foram investigados quanto à presença de genes de virulência e sua relação clonal foi obtida através de amplificação da Região Espaçadora Intergênica (REI) 16S-23S. Quatro genes de Aeromonas (lip, exu, gcat, flaA/B) foram encontrados em alta frequência embora o gene lip tenha se mostrado ausente em algumas espécies. Um quinto gene, aerA, foi raramente encontrado em A. caviae, a espécie mais abundante. O perfil da REI revelou alta heterogeneidade entre os isolados de Aeromonas e nenhuma correlação com espécie. Em contraste, todas as amostras de V. cholerae amplificaram os genes investigados (ctxA, tcpA, zot e ace) e revelaram perfil clonal através de REI e RAPD. Embora Aeromonas tenha sido o principal patógeno isolado, o perfil da REI não é compatível como única causa para os eventos de diarréia, enquanto a relação clonal de V. cholerae aponta esse microrganismo como o provável agente do surto. Estes resultados reforçam a necessidade de definir melhor o papel de Aeromonas em diarréias e de que forma essas bactérias se beneficiam quando em co-infecção com V. cholerae.
Assuntos
Humanos , Aeromonas/genética , Coinfecção/microbiologia , Surtos de Doenças , Diarreia/microbiologia , Infecções por Bactérias Gram-Negativas/microbiologia , Vibrio cholerae O1/genética , Aeromonas/patogenicidade , Brasil/epidemiologia , Coinfecção/epidemiologia , DNA Bacteriano/genética , Diarreia/epidemiologia , Genótipo , Infecções por Bactérias Gram-Negativas/epidemiologia , Reação em Cadeia da Polimerase , Técnica de Amplificação ao Acaso de DNA Polimórfico , Vibrio cholerae O1/patogenicidade , Virulência/genéticaRESUMO
OBJECTIVE: To investigate whether the HlyA-induced vacuolating effect is produced by V. cholerae O1 ElTor strains isolated from different geographic origins, including Mexico. MATERIAL AND METHODS: Supernatant-induced haemolysis, vacuolating activity and cytotoxicity in Vero cells were recorded. PCR, RFLP analysis and molecular cloning were performed. RESULTS: All ElTor strains analyzed induced cellular vacuolation. Ribotype 2 strains isolates from the U.S. gulf coast yielded the highest titer of vacuolating activity. Eight of nine strains were haemolytic, while all strains were PCR positive for the hlyA gene. We cloned the hlyA gene from two ElTor strains, a toxigenic (2514-88, ctxAB+) and a non-toxigenic Mexican strain (CM 91-3, ctxAB-). Supernatant from those recombinant E. coli strains induced haemolysis, cell vacuolation and cytotoxicity. RFLP-PCR analysis revealed similarities in the hlyA gene from all strains tested. CONCLUSION: The HlyA-induced vacuolating effect is a widespread phenotype of epidemic V. cholerae O1 ElTor strains.
OBJETIVO: Analizar el efecto vacuolizante de cepas de V. cholerae O1 ElTor aisladas de diferente origen geográfico, incluyendo México. MATERIAL Y MÉTODOS: Se realizaron pruebas de hemolisis, vacuolización y citotoxicidad en células Vero, así como PCR, análisis por RFLP y clonación molecular. RESULTADOS: Todas las cepas indujeron el efecto vacuolizante. Las cepas del ribotipo 2, aisladas de las costas del Golfo en Estados Unidos, presentaron títulos altos de vacuolización. El gen hlyA fue amplificado en las nueve cepas mediante PCR, aunque sólo ocho fueron hemolíticas. Se clonó el gen hlyA de una cepa toxigénica (2514-88, ctxAB+) y de una cepa no toxigénica aislada en México (CM 91-3, ctxAB-). El sobrenadante de las clonas recombinantes indujo hemólisis, efecto vacuolizante y citotoxicidad. El RFLP mostró alta similitud del gen hlyA de las cepas estudiadas. CONCLUSIÓN: El efecto vacuolizante es un fenotipo ampliamente distribuido en cepas epidémicas de V. cholerae O1 biotipo ElTor.
Assuntos
Animais , Proteínas de Bactérias/toxicidade , Cólera/virologia , Meios de Cultivo Condicionados/toxicidade , Proteínas Hemolisinas/toxicidade , Células Vero/microbiologia , Vibrio cholerae O1/patogenicidade , Austrália/epidemiologia , Proteínas de Bactérias/genética , Chlorocebus aethiops , Cólera/epidemiologia , DNA Bacteriano/genética , Proteínas Hemolisinas/genética , Hemólise , América Latina/epidemiologia , Fenótipo , Ribotipagem , Romênia/epidemiologia , Estados Unidos/epidemiologia , Vacúolos , Células Vero/ultraestrutura , Vibrio cholerae O1/classificação , Vibrio cholerae O1/genética , Vibrio cholerae O1/isolamento & purificação , Virulência/genéticaRESUMO
Foi avaliada a sensibilidade "in vitro" de 43 cepas de Vibrio cholerae 01 (22 de origem humana e 21 ambientais) com relação a seis antibióticos usados na quimioprofilaxia da diarréia colérica (TET, ERI, CLO, AMP, SUT, NOR ), a cinco produtos naturais com atividade antimicrobiana (extratos de B. virgiloides, C. altissiana e P. sellowinus e óleos essenciais de C. citratus e C. limonum), e a duas imidas semi-sintéticas análogas de filantimidas. Todas as cepas foram sensíveis a TET, AMP, CLO. SUT e NOR. Apenas uma, de origem humana, foi resistente a ERI. Dos fitoterápicos, tiveram atividade antimicrobiana os óleos essenciais "in natura" e as duas imidas semi-sintéticas. O óleo de C. citratus inibiu o crescimento de todas as cepas com halos ≥16mm e o de C. limonum inibiu apenas 41% com halos médios de 10mm. A atividade antimicrobiana destes óleos é atribuída a seus constituintes químicos (pineno, E-citral, 7-citral, α-terpinemo, mirceno e citronela). As imidas apresentam forte atividade antimicrobiana em concentrações ≥12,3 µg/mL. Os extratos de B. virgiloides (leguminoseae), C. altissiana e P. sellowinus (Euphorbiaceae), apesar de apresentarem constituintes químicos como alcalóides, taninos, e óleos com propriedade antimicrobiana, não apresentaram atividade, provavelmente por terem maior efeito contra bactérias Gram positivas. Os resultados sugerem o possível emprego de produtos naturais como alternativos no tratamento da cólera.