Estudo da contribuição da autofagia para a susceptibilidade por L. Amazonensis ou resistência por L. Major na infecção de macrófagos murinos da linhagem CBA / Study of the contribution of autophagy to susceptibility by L. Amazonensis or resistance by L. Major in the infection of murine macrophages of the CBA

RESUMO

INTRODUÇÃO: Macrófagos de camundongos CBA controlam a infecção por Leishmania major, no entanto, são permissivos à infecção por Leishmania amazonensis. Os estudos conduzidos, até o momento, sobre o papel desempenhado pela autofagia na infecção por Leishmania levaram a dados controversos. OBJETIVO: No presente trabalho, avaliamos se a resposta autofágica de macrófagos infectados pode ser responsável pela diferença no curso da infecção por essas duas espécies de Leishmania. MATERIAL e MÉTODOS e RESULTADOS: Inicialmente, demonstramos por qPCR e por análise de dados de microarranjos públicos que um número maior de genes relacionados à autofagia é modulado positivamente em células infectadas por L. amazonensis em comparação às infectadas L. major. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) demonstrou modulação oposta dos genes relacionados à autofagia entre os macrófagos infectados com L. amazonensis daqueles infectados com L. major. Após 24 h de infecção, a relação LC3-II/Act é aumentada tanto em macrófagos infectados por L. amazonensis quanto nos infectados por L. major em comparação com controles não infectados, mas menos do que em células tratadas com cloroquina. Embora, os vacúolos parasitóforos induzidos por L. major tenham apresentado maior positividade para o marcador degradativo, DQBSA, o recrutamento de LC3 foi maior nos vacúolos parasitóforos induzidos por L. amazonensis. Interessantemente, tanto a indução farmacológica quanto a fisiológica da autofagia aumentaram a viabilidade intracelular de L. amazonensis e L. major, enquanto a inibição da autofagia não teve efeito sobre a viabilidade intracelular desses parasitas. Também demonstramos que a indução da autofagia reduziu a produção de NO por macrófagos infectados por L. amazonensis ou L. major, mas não alterou a atividade da arginase, A análise de componentes principais e agrupamento hierárquico de clusters discriminaram completamente os macrófagos infectados por L. major de células infectadas por L. amazonensis de acordo com a intensidade da infecção e características autofágicas dos vacúolos induzidos por essas duas cepas. CONCLUSÃO: Em conclusão, a infecção por L. amazonensis ou L. major, apesar de ativar similarmente o fluxo autofágico em macrófagos infectados e os parasitos terem sua viabilidade favorecida pela indução da autofagia, promove expressão diferenciada de genes relacionados à autofagia e interação distinta dos vacúolos parasitóforos com compartimentos autofágicos. Essas diferenças são capazes de separar completamente os macrófagos infectados por L. amazonensis daqueles por L. major

ABSTRACT

INTRODUCTION: CBA mouse macrophages (MΦ) control Leishmania major infection yet are permissive to Leishmania amazonensis. The role played by autophagy in Leishmania infection needs further investigation. OBJECTIVE: Thus, we assessed whether activation of autophagic pathway may account for differences in the response of infected MΦ to these two parasite strains. MATERIAL and METHODS and RESULTS: First, we demonstrated by qPCR and by analysis of publicly available microarray data that a greater number of autophagy-related genes (Atg) are positively modulated in cells infected by L. amazonensis compared to those infected by L. major. Ingenuity Pathway Analyses (IPA) demonstrated opposite modulation in genes in L. amazonensisand L. major-infected MΦ. After 24 h of infection, the autophagic flux measured by LC3-II/Act ratio was similarly increased in either L. amazonensis- or L. majorinfected MΦ compared to uninfected cells. Although L. major-induced parasitophorous vacuoles exhibited greater positivity for the degradative marker, DQ-BSA, LC3 recruitment was increased in L. amazonensis-induced parasitophorous vacuoles. Interestingly, autophagy induction enhanced intracellular L. amazonensis and L. major viability, although autophagy inhibition caused no effect on infection profile. We also demonstrated that autophagy induction reduced NO production by Leishmania-infected MΦ, yet did not alter arginase activity. Moreover, principal component analysis completely discriminated L. major-infected MΦ from L. amazonensis-infected cells regarding infection intensity and autophagic features of parasite-induced PV. CONCLUSION: In conclusion, infection by L. amazonensis or L. major, although similarly activates the autophagic flux in infected MΦ and the parasites have their viability favored by autophagy induction, these Leishmania species cause differentiated expression of Atg and distinct interaction of their parasitophorous vacuoles with autophagic vacuoles. These differences are capable to discriminate MΦ infected by L. amazonensis from those infected by L. major