Investigação da quinase IKKß como um alvo terapêutico anti-metastático em câncer de pulmão associado à ativação do oncogene KRAS / Exploring IKKß as an anti-metastatic therapeutic target in KRAS-induced lung câncer

RESUMO

O câncer de pulmão é o tipo de câncer que apresenta o maior índice de mortalidade em todo o mundo. As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são as mutações pontuais no oncogene que codifica a GTPase KRAS. Apesar destas mutações estarem diretamente ligadas à oncogênese, terapias que visam inibir diretamente a proteína Ras falharam em ensaios clínicos. Uma das propriedades mais importantes na oncogênese é a aquisição de capacidade metastática tumoral. Desta forma, o objetivo deste projeto é identificar alvos terapêuticos que inibam as metástases tumorais induzidas pelo oncogene KRAS no pulmão. Com base em relatos recentes mostrando que a forma oncogênica de KRAS promove, não só a iniciação tumoral, mas também promove a aquisição de um fenótipo metastático, a hipótese deste projeto é que (1) a capacidade mestastática tumoral induzida por KRAS no pulmão é potencializada pela quinase IKKß; e (2) que a inibição desta quinase reduzirá a capacidade invasiva celular e metastática tumoral. Esta hipótese foi formulada com base em estudos anteriores, os quais demonstraram que o principal substrato da IKKß, o fator de transcrição NF-κB, é ativado por KRAS em tumores pulmonares in situ de forma dependente da IKKß, que o NF-κB é capaz de promover metástase em diferentes modelos tumorais, e que a inibição da atividade da IKKß com um inibidor farmacológico em um modelo animal de câncer de pulmão induzido por KRAS, diminui o crescimento tumoral e a progressão tumoral para graus histológicos mais avançados. Nosso objetivo era avaliar se a inibição de IKKß é capaz de afetar a migração e invasão de células portadoras de mutação em KRAS in vitro e se a inibição de IKKß é capaz de afetar a capacidade metatática dessas células in vivo. Primeiramente, avaliamos a expressão de enzimas relacionadas ao fenótipo metastático, as metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) e, também uma molécula intimamente relacionada ao processo de adesão mediado por integrinas, FAK (quinase de adesão focal), frente a inibição de IKKß através de um inibidor farmacológico altamente especifico (Composto A) e frente a inibição genética de IKKß por interferência de RNA (siRNA) em células A549 e H358. Avaliamos também a atividade das MMPs frente inibição genética de KRAS (siKRAS) e IKKß (siIKKß) e vimos que IKKß parece modular a expressão ou atividade de MMP-9 e reduz a expressão de FAK. Já a expressão de MMP-2 não apresentou alteração. Posteriormente avaliamos migração na célula A549 e invasão nas células A549 e H358 com inibição de IKKß, por ensaios Transwell, e observamos uma redução da migração e invasão celular in vitro. Em seguida, fomos gerar linhagens celulares paraa expressar luciferase, as linhagens A549 pLUC e H358 pLUC. Os clones A549 pLUC B4 e H358 pLUC F1 com inibição de KRAS e IKKß por interferência de RNA, foram injetados pela veia da cauda nesses camundongos e as metástases foram monitoradas por imageamento in vivo. Houve metástases em 20% dos animais com siIKKß na região anatômica da boca. Os animais que receberam siControle e siKRAS não apresentaram nenhuma metástase visível no equipamento, mas foi observado micrometástases nas análises histológicas dos pulmões. O resultado do experimento de metástase in vivo é inesperado, não só pelo fato de ocorrer no grupo experimental siIKKß, mas também pelo local anatômico do tumor, sendo necessária uma maior investigação do papel de IKKß nesse processo, podendo ser um resultado aleatório. Quando avaliamos em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKß desempenha um papel importante no fenótipo migratório e invasivo de células pulmonares portadoras de KRAS oncogênica, contribuindo para a capacidade metastática

ABSTRACT

Lung cancer is the leading cause of cancer deaths worldwide. The most frequent genetic changes found in lung cancer are driver mutations in the KRAS proto-oncogene. Even though KRAS mutations have been causally linked to the oncogenic process, therapies targeted to oncogenic RAS have failed in clinical trials. One of the main characteristics in oncogenesis is the ability of tumors to acquire metastatic capability. The objective of this project is to identify therapeutic targets that reduce KRASinduced lung cancer metastasis. Based on previous reports that oncogenic KRAS, drives not only tumor initiation, but also promotes a metastatic phenotype, the hypothesis of this project is that (1) the acquisition of metastatic ability induced by KRAS in the lung is potentiated by the IKK kinase; and (2) that IKKß inhibition will reduce KRAS-induced cell invasive properties and KRAS-induced tumor metastasis. This hypothesis has been formulated on the basis of previous studies showing that the main IKKß substrate, the transcription factor NF-κB, is activated by KRAS in lung tumors in situ in an IKKß-dependent manner, that NF-κB is known to promote metastasis in different tumor models, and that pharmacological IKKß inhibition in a KRAS-induced lung cancer mouse model reduces tumor growth and progression to higher histological tumor grades. Our goal was evaluate how inhibition of IKKß affects migration and invasion of KRAS-positive lung cells in vitro and whether inhibition of IKKß is capable of affecting the metatactic capacity of these cells in vivo. First, we evaluated the expression of enzymes involved in the metastatic phenotype, matrix metalloproteinases 2 and 9 (MMP-2 and MMP-9) and also a molecule involved in the integrinmediated adhesion, FAK (focal adhesion kinase), we targeted IKKß by a highly specific IKK inhibitor (Compound A) or with RNA interference in A549 and H358 cells. We also used colorimetric Matrix Biotrak Activity Assay System to measure the activity of MMPs with RNA interference for KRAS (siKRAS) and IKKß (IKKß) and we have seen that IKKß appears to modulate the expression or activity of MMP-9 and decreases the expression of FAK. The expression of MMP-2 did not change. Then we evaluated migration in A549 cell and invasion in A549 and H358 cells with inhibition of IKK by RNA interference or with Compound A treatment in Transwell assays, and observed a significantly reduced cell migration and invasion in vitro. We then generated cell lines to express luciferase, the A549 pLUC and H358 pLUC lines. A549 pLUC B4 and H358 pLUC F1 cells with RNA interference for KRAS and IKKß were injected in the tail vein in nude (balb/c) mice and metastases were monitored by in vivo imaging. There were metastases in 20% of IKKß animals in the anatomical region of the mouth. Animals that received siControl and siKRAS had no visible metastasis in the live imaging, but micrometastases were observed in the histological analyzes of the lungs. The result of this experiment is unexpected, not only due to the fact that it occurs in the IKKß experimental group, but also due to the anatomical site of the tumor, and a further investigation of the role of IKKß in this process, can be a random result. When evaluated together, our results suggest that the IKKß kinase plays an important role in the migratory and invasive phenotype of in KRAS positive lung cancer cells, contributing to metastatic capacity