Validation of reference genes for accurate normalization by quantitative polymerase chain reaction in sugarcane drought stress studies using two cultivars / Validação de genes de referência para normalização de reação em cadeia de polimerase quantitativa em estudos de estresse hídricoem cana-de-açúcar

ABSTRACT

ABSTRACT: The aim of this study was to analyze the expression of putative reference genes in sugarcane under drought stress. The varieties RB72454 and RB72910 were cultivated and the treatments control and drought stress applied to 135-day-old plants grown under field conditions. The stress level of the plants was measured by rate of photosynthesis, transpiration, and stomatal conductance. For each biological replicate, expression analyses were conducted using quantitative polymerase chain reaction for the genes α-tubulin, β-tubulin, β-actin, cyclophilin, eukaryotic elongation factor 1, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), histone H3 and ubiquitin. Stability was evaluated using the geNorm, NormFinder, and BestKeeper software packages. Among the candidate genes, GAPDH was identified as the most stable in all software, indicating its suitability for gene expression studies in sugarcane undergoing drought stress; the gene β-actin was the second most stable. These findings suggest using GAPDH and β-actin for normalization in relative gene expression in sugarcane.

RESUMO

RESUMO: O objetivo do estudo foi analisar a expressão de genes de referência em cana-de-açúcar sob estresse hídrico. As cultivares RB72454 e RB72910 foram cultivadas em campo e os tratamentos controle e estresse foram aplicados após 135 dias. O estresse das plantas foi mensurado utilizando as variáveis fisiológicas: taxa fotossintética, transpiração e condutância estomática. Para cada repetição biológica, a expressão gênica foi conduzida usando PCR tempo real para os genes α-tubulina, β-tubulina, β-actina, ciclofilina, fator 1 de alongamento eucariótico, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), histona H3 e ubiquitina. A estabilidade dos genes foi avaliada usando os softwares geNorm,NormFinder e BestKeeper. Entre os genes candidatos, GAPDH foi identificado como o mais estável nos três métodos de análises, indicando ser estável para estudos de expressão gênica em cana-de-açúcar sob estresse hídrico; seguindo o gene β-actina como o segundo mais estável. Os resultados concluem que os genes GAPDH e β-actina são indicados para normalização em expressão gênica relativa, associada com estresse hídrico em cana-de-açúcar.