Introdução da reação em cadeia da polimerase em tempo real no algoritmo de testes laboratoriais para o diagnóstico de infecção por HTLV-1 e HTLV-2 / Use of the real-time polymerase chain reaction in the HTLV-1 and HTLV-2 infections diagnostic testing algorithm

RESUMO

Em vista das dificuldades encontradas no diagnóstico de infecção por vírus linfotrópicos de células T humanas dos tipos 1 e 2 (HTLV-1 e HTLV-2) no Instituto Adolfo Lutz (IAL) de São Paulo, foi proposto o presente estudo que objetivou avaliar o valor do cut-off dos testes de triagem sorológica e os algoritmos de testes laboratoriais, dando ênfase ao emprego da reação em cadeia da polimerase (PCR) como teste confirmatório. Do total de 3.271 amostras de sangue provenientes da rotina diagnóstica dos anos de 1998 a 2010 (a) 2.312 amostras de soro (1998-2006) foram empregadas para estabelecer o melhor valor de cut-off para os ensaios imunoenzimáticos (EIAs) usando a análise ROC (receiving operating characteristics); (b) 313 amostras de sangue (2009) foram analisadas por algoritmo de duas coletas seqüências de sangue; (c) 73/959 amostras de sangue reagentes na triagem sorológica (2007-2010) foram empregadas no estudo comparativo de sensibilidade e custo dos testes confirmatórios de Western blot (WB), PCR convencional (tax e pol) e PCR em tempo real (pol). As PCRs foram otimizadas usando DNA extraído de linhagens celulares infectadas por HTLV-1 (C91-PL) e por HTLV-2 (BBF) e realizada pesquisa de gene da albumina humana como controle endógeno. Os resultados da análise ROC mostraram que um ajuste no valor do cut-off dos EIAs de 3ª geração aumentou a especificidade desses ensaios em 7,8%, sem alterar significativamente a sua sensibilidade. O algoritmo de coleta seqüencial de sangue se mostrou inadequado sendo mais apropriada a coleta única em tubo contendo anticoagulante. Os resultados do ensaio confirmatório de WB mostraram que este foi mais sensível (90,56%) do que a PCR convencional (77,36%) e a PCR em tempo real (79,25%), provavelmente pela pequena carga proviral de HTLV-1 e HTLV-2 presente no sangue, principalmente de portadores assintomáticos. Todavia, as técnicas de PCR se mostraram úteis na elucidação de amostras com padrão indeterminado à análise pelo WB, sendo os ensaios sorológicos e moleculares complementares. Concluindo, em vista da PCR em tempo real ser um teste rápido, seguro, de menor custo e de fácil execução, ele pode ser aplicado como primeiro teste confirmatório de infecção por HTLV-1 e HTLV-2 seguido do WB (AU).

ABSTRACT

Taking into account the difficulties in diagnosing the human T-cell lymphotropic virus type 1 and type 2 (HTLV-1 and HTLV-2) in Instituto Adolfo Lutz of São Paulo, the present study was conducted aiming at evaluating the cut-off values of screening enzyme immunoassays (EIAs) and the tests algorithms, emphasizing the use of polymerase chain reaction (PCR) as confirmatory assay. Of 3,271 blood samples routinely analyzed from 1998 to 2010 (a) 2,312 serum samples (1998-2006) were assessed for the best cutoff value by using the receiving operating characteristics analyses (ROC); (b) 313 blood samples (2009) were tested following the algorithm which employs two sequential blood collection, and (c) 73/959 blood samples (2007-2010) showing reactive results on screening testing were employed for comparative analysis of serologic (Western blot ­ WB) and molecular confirmatory assays [PCR (tax and pol) and real time PCR (pol)]. The PCRs were optimized using the cells lines infected with HTLV-1 (C91-PL) and HTLV-2 (BBF), and the human albumin gene. The ROC analysis showed that an adjustment of the cut-off value in the third generation EIAs increased their specificity in 7.8%. The use of the sequential blood collection algorithm for serological diagnosis was completely inefficient and a unique blood collection in an anticoagulantcontaining tube seems to be the most appropriate. The WB confirmatory assay resulted to be more sensitive (90.56%) than the standard PCRs (77.36%) and the real-time PCR (79.25%), probably owing to the low HTLV-1 and HTLV-2 proviral load in asymptomatic carriers' blood. However, the PCRs were able in elucidating the samples with indeterminate WB profile, thereby standing the serologic and molecular assays as complementary tests. In conclusion, because of the low cost, rapidity, reliability and easiness to perform, the real-time PCR could be used as the first confirmatory assay for performing the HTLV-1 and HTLV-2 diagnosis, followed by the WB technique (AU).