Comparação do perfil antigênico de Paracoccidioides brasiliensis e paracoccidioides lutzii para o imunodiagnóstico da paracoccidioidomicose / Purchase of the antigenic profile of Paracoccidioides brasiliensis and paracoccidioides lutzii for the immunodiagnosis of paracoccidioidomycosis

RESUMO

A paracoccidioidomicose (PCM) é causada por fungos do gênero Paracoccidioides Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii. A micose apresenta alta endemicidade na América do Sul e aproximadamente 80% dos casos descritos são registrados no Brasil. P. lutzii, tem sido apontado como agente causal da PCM, especialmente nas regiões Centro-Oeste e Norte, entretanto, alguns grupos têm relatado, a ausência de reatividade sorológica dos pacientes frente ao antígeno de referência de P. brasiliensis, conhecida por apresentar em sua composição a molécula de 43 kDa. Este estudo tem como principal objetivo estabelecer um protocolo para a produção de antígenos de P. lutzii que possam ser utilizados como referência em ensaios sorológicos para esta espécie. As preparações antigênicas foram obtidas a partir de três isolados (01, 66 e 8334), cultivados à 37ºC, empregando-se dois meios de cultura distintos, ágar Fava-Netto modificado e ágar Sabouraud-dextrose, segundo os protocolos descritos por Freitas (2005) e Assis et al. (1989), sendo que um terceiro protocolo foi proposto durante o desenvolvimento deste projeto. Os antígenos foram obtidos após cinco (5), 10 e 20 dias de cultivo e foram avaliados in natura, 10 e 20 vezes concentrados por liofilização. Considerando-se os diferentes pontos avaliados, este projeto gerou a produção de 90 preparações antigênicas. O screening das preparações antigênicas com potencial aplicabilidade no imunodiagnóstico da PCM causada por P. lutzii, permitiu a seleção de seis antígenos quatro produzidos a partir do protocolo descrito por Freitas (2005), sendo três obtidos em ágar Fava-Netto modificado e um em ágar Sabouraud-dextrose e dois obtidos segundo o protocolo proposto durante o desenvolvimento deste projeto, ambos obtidos em Fava-Netto modificado. Verificou-se que todas as seis preparações antigênicas, apresentaram reatividade cruzada frente a soros de pacientes com PCM confirmada e residentes em região não endêmica para P. lutzii, bem como para soros de pacientes com PCM confirmada ou com suspeita clínica da micose, residentes em regiões endêmicas para P. lutzii. Observou-se que o uso do immunoblotting melhorou a sensibilidade do diagnóstico da PCM, porém, reafirmou a ocorrência de reatividade cruzada entre as espécies de Paracoccidioides sp, já que diversas amostras de soro reconheceram tanto os marcadores sorológicos da infecção por P. brasiliensis (gp43 e gp70), assim como diversas frações de P. lutzii, com destaque a fração de 60 kDa. A comparação do perfil eletroforético, por SDS-PAGE, confirmou o compartilhamento de componentes antigênicos entre ambas as espécies de Paracoccidioides, justificando assim, a ocorrência de reatividade cruzada. Diante destes resultados, conclui-se que não é possível discriminar, sorologicamente PCM causada por P. brasiliensis daquela causada por P. lutzii. (AU)

ABSTRACT

Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by fungi of the genus Paracoccidioides Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii. Mycosis has high endemicity in South America and approximately 80% of the described cases are registered in Brazil. P. lutzii, has been reported as a causative agent of PCM, especially in the Midwest and North regions. However, some groups have reported the absence of serological reactivity of the patients against the reference antigen of P. brasiliensis, known to present in its composition to the 43 kDa molecule. This study has as main objective to establish a protocol for the production of P. lutzii antigens that can be used as reference in serological tests for this species. The antigenic preparations were obtained from three isolates (01, 66 and 8334) grown at 37ºC using two different culture media, modified Fava-Netto agar and Sabouraud-dextrose agar, according to the protocols described by Freitas (2005 ) and Assis et al. (1989), and a third protocol was proposed during the development of this project. Antigens were obtained after five (5), 10 and 20 days of culture and were evaluated in natura, 10 and 20 times concentrated by lyophilization. Considering the different evaluated points, this project generated the production of 90 antigenic preparations. The screening of the antigenic preparations with potential applicability in the PCM immunodiagnosis caused by P. lutzii allowed the selection of six antigens four produced from the protocol described by Freitas (2005), three being obtained on modified FavaNetto agar and one on Sabouraud-dextrose agar and two obtained according to the proposed protocol during the development of this project, both obtained in modified Fava-Netto. All six antigenic preparations were cross reactive to sera from patients with confirmed PCM and resident in a region not endemic to P. lutzii, as well as to sera from patients with confirmed PCM or with clinical suspicion of mycosis residing in endemic regions for P. lutzii. It was observed that the use of immunoblotting improved the sensitivity of the PCM diagnosis, but reaffirmed the occurrence of cross reactivity among the species of Paracoccidioides sp, since several serum samples recognized both the serological markers of infection by P. brasiliensis (gp43 and gp70), as well as several fractions of P. lutzii, with emphasis on the fraction of 60 kDa. The comparison of the electrophoretic profile, by SDS-PAGE, confirmed the sharing of antigenic components between both species of Paracoccidioides, thus justifying the occurrence of cross-reactivity. In view of these results, we conclude that it is not possible to discriminate serologically PCM caused by P. brasiliensis from that caused by P. lutzii.(AU)