Evaluación de la proteólisis en células aisladas vivas de Plasmodium falciparum aisladas durante los estadios asexuales sanguíneos / Proteolysis assessment in isolated Plasmodium falciparum living cells at the asexual blood stages

ABSTRACT

It has been demonstrated that proteases play crucial roles in Plasmodium falciparum infection and therefore have been considered as targets for the development of new therapeutic drugs. The aim of this study was to describe the specific proteolytic activity profile in all blood stages of P. falciparum isolated parasites in order to explore new antimalarial options. For this purpose, we used the fluorogenic substrate Z-Phe-Arg-MCA (Z carbobenzoxy, MCA 7-amino-4-methyl coumarine) and classic inhibitors for the different classes of proteolytic enzymes, such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1.10-phenantroline, pepstatin A and E64 to study the inhibition profiles. As expected, due to the high metabolic activity in mature stages, the substrate was mostly degraded in the trophozoite and schizont, with specific activities ~ 20 times higher than in early stages (merozoite/rings). The major actors in substrate hydrolysis were cysteine proteases, as confirmed by the complete hydrolysis inhibition with E64 addition. Proteolytic activity was also inhibited in the presence of PMSF in all but the schizont stage. However, PMSF inhibition was the result of unspecific interaction with cysteine proteases as demonstrated by reversion of inhibition by dithiotreitol (DTT), indicating that serine protease activity is very low or null. To our knowledge, this is the first report aiming to describe the proteolytic profile of P. falciparum isolated parasites at all the erythrocytic cycle stages. The results and protocol described herein can be useful in the elucidation of stage specific action of proteolysis-inhibiting drugs and aid in the development of antimalarial compounds with protease inhibitory activity(AU)

RESUMEN

e ha demostrado que las proteasas desempeñan funciones vitales en la infección por Plasmodium falciparum, y por lo tanto se consideran dianas en la elaboración de nuevos medicamentos terapéuticos. El objetivo del estudio era describir el perfil de actividad proteolítica específica de todas las etapas sanguíneas de parásitos aislados de P. falciparum con vistas a explorar nuevas opciones antimaláricas. Con ese propósito, utilizamos el sustrato fluorogénico Z-Phe-Arg-AMC (Z carbobenzoxi, AMC 7-amino-4-metilcumarina) e inhibidores clásicos para las diferentes clases de enzimas proteolíticas, tales como el fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1,10-fenantrolina, pepstatina A y E64 para estudiar los perfiles de inhibición. Como se esperaba, debido a la elevada actividad metabólica de las etapas de madurez, el sustrato fue degradado mayormente en el trofozoíto y el esquizonte, con actividad específica ~ 20 veces superior a la de las etapas tempranas (merozoíto/ anillos). Los principales actores en la hidrólisis del sustrato fueron las cisteínas proteasas, lo que fue confirmado por la inhibición completa de la hidrólisis con la adición de E64. La actividad proteolítica también fue inhibida en presencia de PMSF en todas las etapas excepto el esquizonte. Sin embargo, la inhibición del PMSF fue resultado de una interacción inespecífica con las cisteínas proteasas, según lo demuestra la reversión de la inhibición con el ditiotreitol (DTT), lo que indica que la actividad de la serina proteasa es muy baja o inexistente. Que sepamos, este es el primer informe dirigido a describir el perfil proteolítico de parásitos aislados de P. falciparum en todas las etapas del ciclo eritrocítico. Los resultados y el protocolo que aquí se describen pueden ser útiles para dilucidar la acción específica de los medicamentos inhibidores de proteólisis en cada etapa, así como contribuir al desarrollo de compuestos antimaláricos con actividad inhibidora de la proteasa(AU)