Influencia del medio de cultivo sobre la cinética de crecimiento y expresión de la proteína recombinante Rv2626c de Mycobacterium tuberculosis H37Rv expresada en Streptomyces lividans TK24 / Influence of the culture medium on the kinetics of growth and expression of the recombinant protein Rv2626c of Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressed in Streptomyces lividans TK24

RESUMEN

Streptomyces lividans, ha ganado gran atención en los últimos tiempos, como vector de expresión y producción de proteínas de Mycobacterium tuberculosis de interés biomédico, como alternativa a su obtención tradicional en E. coli. La proteína Rv2626c, Proteína de Respuesta Hipóxica 1, es codificada por el gen Rv2626c (hrp1) de M. tuberculosis, perteneciente al regulón de la fase de latencia DosR. Esta proteína se sobre-expresa en la fase de latencia de la tuberculosis bajo condiciones de estrés como hipoxia y bajos niveles, de óxido nítrico. Se ha demostrado la inmunogenicidad y capacidad de esta proteína, de inducir citocinas características del patrón Th-1, tales como el interferón gamma. Por ello, nuestro grupo logró la obtención de Rv2626c por la tecnología del ADN recombinante usando como cepa hospedera Streptomyces lividans TK24. Con el objetivo de aumentar el nivel de expresión de la proteína recombinante, rRv2626c en este trabajo se ensayaron diferentes medios de cultivo, evaluando el crecimiento de la cepa transformada en condiciones de zaranda. Se determinó la cinética de crecimiento en el medio definido, formulado industrialmente en el Centro Nacional de Biopreparados caldo Triptona Soya (TSB-BioCen) y en medio de cultivo equivalente preparado en el laboratorio. Para establecer la cinética de crecimiento, se utilizó el cálculo del peso seco y la determinación de la concentración de proteínas totales por la técnica de ácido bicinconinico (BCA) a diferentes tiempos del cultivo. Posteriormente, se identificó la proteína clonada mediante SDS-PAGE y Western Blotting, así como los niveles de expresión mediante análisis densitométrico. Los resultados indican que se alcanzaron los máximos niveles de densidad celular a las 36 h de cultivo y los más altos niveles de expresión proteica total y específica entre las 42 y 54 h. Con el medio químicamente definido TSB-Biocen preformulado en lugar del preparado en el laboratorio partiendo de los componentes, se logró reducir el tiempo óptimo para la expresión-secreción de la proteína rv2626c de 96 a 54 h. Los mejores resultados en la promoción de la expresión de la proteína recombinante se lograron con el medio definido TSB-BioCen, a las 48 h con 8,5% de rendimiento específico, superando en más de 10 veces los niveles de crecimiento celular obtenidos con el medio elaborado en el laboratorio y más de dos veces los niveles de secreción de la proteína recombinante(AU)

ABSTRACT

The use of Streptomyces as a bacterial cell factory for the secretory production of bio-active Mycobacterium tuberculosis proteins have gained a lot of attention in recent years, as a convenient alternative to the traditionally used Escherichia coli. The protein Rv2626c protein, also known as Hypoxic Response Protein 1 (HRP1), is encoded by the gene rv2626c (hrp1) of M. tuberculosis which belongs to the Dormancy Safety Regulator (DosR) regulon. This protein is over-expressed during the latency phase of tuberculosis under stress related conditions such as hypoxia and low, non-toxic, levels of nitric oxide and, the immunogenicity and ability to induce cytokines characteristic of the Th-1 pattern of this protein, such as gamma interferon, have been demonstrated. On this basis, our working group, succeeded in obtaining rRv2626c via recombinant DNA technology using Streptomyces lividans TK24 as the host cell. To improve the expression level of the protein, different culture media were used to evaluate the growth of the transformed strain in shaken flask conditions. Growth kinetic for the recombinant strain was evaluated in defined media of preformulated tryptic soya broth (TSB-Biocen), through the determination of dry weight as well as total protein concentration by Bicinconinic acid assay (BCA). Protein identification was done by SDS-PAGE, Western Blot and its expression level by densitometric analysis. Our results indicated a maximal cell density at 36 h of culture, with higher concentration of total and specific protein at 42-54 h in comparison with previous media used. With the chemically defined media a preformulated TSB-Biocen rather than individual components, culture time for expression/secretion of rRv2626c was reduced from 96 h to 54 h. The best results in expression-secretion levels of rv2626c protein were obtained with the TSB-Biocen defined media at 48 h of culture with 8.5% of specific yield. More than 10 fold increase in cellular growth and more than 2 fold increase in specific yield(AU)