Isolation of phytoplasmas associated to frogskin disease in cassava / Aislamiento de fitoplasmas asociados a cuero de sapo en yuca

ABSTRACT

ABSTRACT Frogskin is the most limiting disease of cassava crops in Colombia, causing losses in production up to 90%. Since this disease was associatated with 16SrIII phytoplasma presence, a study was carried out to isolate this phytoplasma using liquid and solid culture media. Root, petiol, stem, leaf and cutting tissues of cassava affected by frogsking were employed as source materials. Molecular and microscopy techniques were applied to verify the phytoplasma growth and to discard other microorganism´s presence. The results showed that the media consistently allow phytoplasma growth, and colonies in solid medium were obtained. PCR, qPCR and sequencing tests confirmed the presence of 16SrIII group phytoplasmas in both liquid and solid culture media. Additionally, the isolation of a pigeon pea witches' broom phytoplasma strain (group 16SrIX) was obtained from stems, petioles and flowers of symptomatic Catharanthus roseus confirming the effectiveness of the medium in the phytoplasma isolation and culture. This is the first isolation of field-collected phytoplasma strains in groups 16SrIII and 16SrIX in America that confirm and corroborate the previous results in phytoplasma cultivation achieved on micropropagated and field-collected phytoplasma infected samples.

RESUMEN

RESUMEN En Colombia, el ''cuero de sapo'' es la enfermedad más limitante del cultivo de yuca, que ocasiona pérdidas en producción de raíces hasta del 90%. La presente investigación tuvo como objetivo, el aislamiento in vitro del fitoplasma asociado a cuero de sapo. Para ello, se emplearon medios de cultivo líquido y sólido, usando tejidos de raíces, peciolos, tallos, hojas y semillas de yuca, afectada por la enfermedad. Pruebas de PCR, qPCR, secuenciación, microscopia de luz y microscopia electrónica de transmisión fueron aplicadas, para verificar el crecimiento de fitoplasmas y descartar la presencia de otros microrganismos. Los resultados muestran que los medios permiten, consistentemente, el crecimiento de fitoplasmas, obteniendo colonias en medio sólido a partir de medio líquido. Las pruebas de PCR, qPCR y secuenciación confirmaron presencia de Cassava frogskin phytoplasma del grupo 16SrIII, en los dos medios de cultivo. Además, a partir de las colonias, se lograron fotografías de células con morfología y tamaño similares a las fitoplasmáticas. Es la primera vez, en el mundo, que se consolida información suficiente del aislamiento de fitoplasmas en medio artificial. Adicionalmente, se logró el aislamiento de Pigeon pea witches´ broom phytoplasma del grupo IX, a partir de tallos, peciolos y flores de vinca (Catharanthus roseus), con síntomas asociados a fitoplasmas. Este proceso permitió corroborar la efectividad del medio y la morfología de las células fitoplasmáticas, bajo microscopia electrónica.